• ベストアンサー
  • すぐに回答を!

PCR産物

ある特定遺伝子のmRNAをRT-PCRにより増幅します。 仮にですが、目的のmRNAの全長は1000bpで、逆転写反応後プライマーを用いて増幅させると500bpの産物が得られるとします。 その後ネガティブコントロールを行い、さらにF.W.のみとR.V.のみで反応を行います。 この結果(電気泳動パターン、産物の大きさ等)はどのようになると予想されますか?

共感・応援の気持ちを伝えよう!

  • 生物学
  • 回答数2
  • 閲覧数1685
  • ありがとう数3

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
  • 回答No.2
  • methyl
  • ベストアンサー率50% (29/58)

あくまでも”理論的には”見ることが出来ます。 しかし、通常のPCRではテンプレートを100万倍以上に増幅すると考えられています。つまり、片側のプライマーだけで増幅させるには、Taqが40cyclesで失活すると仮定すると、少なくとも数万回PCRを繰り返さなければいけないわけです。実際にはprimer dimerであるとか非特異的な増幅も起こりますし、テンプレート量の比較的少ないRT-PCRでは現実的にはかなり難しいですね。 ただし、テンプレートが十分にあれば可能です。というか、シークエンス反応はまさに片側のプライマーで増幅させて、電気泳動で確認することができるわけですよね。 そういうわけで、十分なテンプレート量があると仮定すると、 片側のprimerからmRNAの橋までの距離の部分が最も強く(シークエンス反応と異なりddNTPsが無いので)、そこから分子量の低い方へブロードとなった泳動像が得られると想像されます。

共感・感謝の気持ちを伝えよう!

質問者からのお礼

実に様々な問題が絡んで、現実には理論的にことを進めるのはとても困難なのですね。 しかし、今回の質問は実際に片側のみのプライマーを使用しRT-PCRを行ってバンドが確認できなかった故のものだったので、その理由がわかったのでよかったです。 幾度にわたる質問に対し、迅速かつ丁寧なご回答有り難うございました。

その他の回答 (1)

  • 回答No.1
  • methyl
  • ベストアンサー率50% (29/58)

まず用語の設定が不明ですので、 ネガコン=テンプレートをMQW F.W.のみ=reverse primerの代わりにMQW R.V.のみ=forward primerの代わりにMQW と仮定すると 通常のPCRのサイクル数(25~45)で行う限り いずれもバンドは見られないでしょうね。 primerは片側のみでも一応増幅されますが 通常のPCRが相対量としてサイクル毎に 1→2→4→8→16→32・・・ 片側だけだと 1→2→3→4→5→6・・・ だから電気泳動で見える量にはならないですよね。

共感・感謝の気持ちを伝えよう!

質問者からのお礼

稚拙な質問文に対してご回答を求めてしまいすみませんでした。 片側のプライマーのみでも増幅はされるのですね。 しかし結果としてバンドが見られないのは確認できるだけの産物量がないということで、サイクルごとの増加量のご説明からもそのことはよく理解できました。 では、サイクル数を増やせば確認できるだけの産物が得られるのでしょうか。単純に考えるとそういうことになると思うのですが・・・ 無知なものでとても初歩的な質問かと思いますが、教えていただけたら幸いです。

関連するQ&A

  • PCR増幅産物のbp

    生化学初心者で困っています。現在PCRを行っているのですが、過去に先輩が注文したプライマーを使用しており、増幅産物が何bpのものができるのかわかりません。プライマーの配列はわかるのですが、どうにか調べる方法はないでしょうか?

  • RT-PCR

    RT-PCRでcDNAの作成を行っています 通常は、 RNA抽出物を逆転写して (polyA primerで) PCRへもっていっています。 しかし 先日ふと思い立って、 RNA抽出物を鋳型として そのままPCRしてみました。 すると、このRNA抽出物を鋳型としてPCRした場合も、 cDNAを鋳型とした時と同じ位置にバンドが出てきました。 このバンドは、鋳型RNAをRNAse Aで処理すると消えます。 このPCR産物の シークエンスをチェックしてみると、 目的遺伝子であることが確認できました。 (全長800bpの中の500bpのシークエンスを確認) RNA抽出キットはキアゲン社のものを使っています。 精製度が高いということなのでDNase処理は行っていません。 この場合、 RNAを鋳型として 目的遺伝子が増幅しているのでしょうか? あるいは、 ゲノムDNAがコンタミが原因で イントロンを含んだものが増えているのでしょうか? 通常、 DNA polはRNAを鋳型として 遺伝子増幅できないといわれていますが、 本当でしょうか? 何か参考になる文献があれば 教えていただけないでしょうか? よろしくお願いいたします。

  • RT-PCRについて

    RT-PCRの質問です。 RNAからcDNAに逆転写するときに、Randam Primerと いうものがありますが、これってランダムにRNAに くっつくのですよね?だからいろんな長さのcDNAが できてしまうと思うのですが、Randam Primerを使っても 大丈夫でしょうか?Randam Primerの他に、オリゴdT Primer というのもありますが、どっちが逆転写に良いのでしょうか? あと、cDNAを増幅させるときのPCRで、遺伝子特異的な プライマーを使おうと思うのですが、1つのサンプルに センスとアンチセンスのプライマーを混ぜても大丈夫 なのでしょうか?あらかじめセンスとアンチセンスを 等量混ぜたプライマー液を作っといて、反応液に混ぜれば 良いのでしょうか?

  • プライマーなしでのOverlap Extension PCRについて

    異なる遺伝子(PCR産物)を鋳型にしたPCRで、プライマーを付けずに伸長反応をさせることにより、異なる遺伝子をつなぎ合わせて、その後プライマーを入れてのPCR反応により、異なる遺伝子をつなげて増幅できると論文にありましたが、プラマーがないと異なる遺伝子が反応せずに残るのではないかという意見もありました。 このようなOverlap Extension PCR場合、サイクル数、プライマーの有無はどのようにすればよいのでしょか?

  • RT-PCRとリアルタイムPCRのプライマーの違い

    初歩的な質問ですがご助言願います。 リアルタイムPCR用に設計したプライマーを用いて RT-PCRをかけようと思うのですが そもそも、この2つのPCRのプライマーに設計上の違いはあるのでしょうか? 違いがあれば、RTではうまくいかないのでは?と思っています。 ちなみにこのプライマーでできるターゲット産物のサイズは400bp程度です。

  • PCRで複数のバンドがでます。

    初歩的な質問ですいません。 PCRをしています。PCR産物を電気泳動すると、複数のバンドがでます。なぜでしょうか? たとえば、100、200、300塩基の長さのバンドがでるとすると、これらはすべて、用いたプライマーによって増幅されたものなのでしょうか?それとも、プライマーの配列と完全に一致しなくても、このようなバンドがでるのでしょうか?

  • RT-PCRトラブルシューティングとして

    こんにちわ。RT-PCRの初心者です。アドバイスを頂けたらと思います。 ある目的の遺伝子のmRNAを抽出してcDNA合成後、PCRで増幅してバンドを確認したいのですが、バンドが確認できません。 TRIZOLでの抽出及びキアゲン社のRNeasykitの両方で試しましたがうまくいきませんでした。OD260/280の値から見ると1.8-2.0で純度も悪くないと思います。そこから濃度計算しておよそ1μgほどをテンプレートとしています。RTにはキアゲン社のOneStepRT-PCRを使っています。 そこからPCR後に泳動するとバンドが確認できません。(ポジコンのサンプルです)違うサンプルではバンドが出ていたのでプライマーやアニーリングには問題が無いと思います。泳動も問題ないと思います。 そうなると抽出か分解かになると思うのですが・・。 自身で考えられることはしましたが改善できませんでした。 何か考えられる問題点とアドバイスをいただけたらよろしくお願いいたします。

  • PCR産物を電気泳動すると・・・

    PCR産物を電気泳動すると、ひきずって流れているように筋のようなものができて流れていきます。 バンドも見えるのですが、筋があるのではっきりとは見れません。 ちなみにゲルはすでに作られているものを用いているので、ゲル以外に原因があると思っています。しかし、PCRにかけるときはプライマーとDNAとmilliQしか入れていません。 同じような経験がある方、原因がわかる方いらっしゃったらお願いします。

  • PCRについて

    PCRについて PCR反応でmRNAを増幅することはできるのですか? また、mRNAを増幅したい場合にはどのような実験を行えばいいのですか? どなたかわかる方、回答していだだけると幸いです。

  • アガロースゲル電気泳動におけるPCR産物バンドの乱れ

     600 bpくらいのDNA配列をPCRで増やし、その産物をPEG沈して精製しているのですが、PCR直後の電気泳動(1.5% TBE gel)では1本のバンドなのですが、PEG沈後の電気泳動では2本になっています。  分子量で見ると、産物のバンド(600 bp)に加えて、450bp程度のバンドが新たに出現します。精製中に分解したのでしょうか?(でも、DNaseのコンタミだったらもっとズタズタに切れますよね)。それとも、精製過程で産物の一部が何か高次構造のようなものをとって、電気泳動上で二本になって見えるのでしょうか?  原因についてご存知の方、あるいは同じ経験をされた方、教えてください。