PCRについて質問があります。

質問

ある特定の遺伝子をサイバーグリーンを用いたqRT-PCRで定量したのですが、うまくいきませんでした。その遺伝子は、通常のPCRでは、ちゃんとシングルのバンドが強く検出できます。しかし、同じサンプルをサイバーグリーンを用いたqRT-PCRでやるとうまくいきません。しかし、スタンダートカーブとして使うPCR産物は、増幅可能という理解不能な結果が出ます。
　プライマー、テンプレート、マグネシウムの濃度勾配も試しましたが、うまくいきませんでした。しかも、ハウスキーピングの遺伝子は、同じサンプル中で綺麗に定量できます。こうなると、違いは、プライマーのみとなりますが、どうしてこうなるのか、もうお手上げ気味です。なにか提案のある方がいらしゃればお願いします。

回答No.2

browntraut

通常のPCR時と同じプライマーですか？であれば、q-PCRのextensionが短すぎるとか。
通常のPCRと違うプライマーなら反応条件に合ってないのではないでしょうか？q-PCRにかけたサンプルを流してみてはどうですか？短くてもバンドが見えると思います。バンドがなければ反応がうまくいっていないし、バンドがあれば、サイバーの蛍光がちゃんと読めていないということでしょうか。

回答No.1

warudori

酵素が違うのですから反応性に差がでることは不思議ではありません。

スタンダードが引けるということは、サンプル中にターゲットのmRNA(cDNA)が発現していないか、発現していても発現量（鋳型DNA）が少なくて正確に立ち上がってこないということはありませんか？

後はスタンダートが本当に目的の遺伝子を増やしているのか、疑う必要もあるかもしれません。

どうしても解決しなければ、ここでの質問を締め切ったあとに「バイオテックフォーラム」で相談してみるといいいかもしれません。

補足

ご解答ありがとうございます。

スタンダードが引けるということは、サンプル中にターゲットのmRNA(cDNA)が発現していないか、発現していても発現量（鋳型DNA）が少なくて正確に立ち上がってこないということはありませんか？

　すいません。仰っている意味がよくわかりません。ただ、スタンダードは、ポジティブの組織から得られたcDNAで作ったPCR産物を使用しておりますが、同じプライマーを使用して、ある組織からのcDNAを使って通常のPCRでも、この目的遺伝子のポジティブの組織から得られたcDNAと同じよう強度で検出できます。つまり、質問にも明確に示しておりますが、かなり多く発現しております！！

　それに、ネガティブの組織のcDNAには、何も検出されず、NoRTコントロールもきれいなネガティブコントロールとなっています。また、バンドのサイズもポジティブと比べて全く同じで、BLASTサーチでも、目的遺伝子のみ増幅する結果が出ています。ただ、シークエンスだけは、まだ行っていません。というのも、年末で、core facility が正月明けまでおかないので、できない状態です。

　酵素が違うと言う指摘ですが、ハウスキーピングやほかの遺伝子は、同じサンプル中でも全く問題なく普通のPCR同様、サイバーグリーンでも検出可能です。ただ、この特定遺伝子のみ検出できません。それが、普通のPCRで検出できなければ、プライマーが悪いと結論付けることも簡単ですが、そうでないので、苦労しております。

　特定の遺伝子配列で、サイバーグリーンの系が働かないという風に考えるのも、納得がいかないので、頭を悩ませているところです。