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定量PCRのスタンダード作製

最近、リアルタイムPCRで増幅産物の定量を行うようになったのですが、 市販されているプライマーとスタンダードのセットでしか測定をしたことがありません。 自身でデザインしたプライマーで増幅した産物の定量を行いたい場合、 スタンダードはどのように作製したら良いのでしょうか? PCRの増幅産物をプラスミドにクローニングしてスタンダードを作製するようなことを読んだのですが、悲しいことに理解できずにおります。 また、塩基配列が判明している変異遺伝子やウイルス検出にあたり、手元に陽性コントロールとなるサンプルがないとスタンダードを作ることは無理でしょうか? 具体的な解説、初心者向けのおすすめ書籍・webサイト等がありましたら、教えてもらえないでしょうか。

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  • 回答No.1

リアルタイムならやはりApplied Biosystemsが詳しいです。 アプリケーションマニュアルもご専門にあわせてどうぞ。 http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/product/ctlgpage.jsp?PLCD=46 私の場合、スタンダードは増幅がかかるターゲットよりちょい広め(200bpくらい?)のPCR産物を精製して、分子数に換算しています。 収量(重さと濃度)から分子数(mol)への変換はよろしいでしょうか。 (realtime RT-PCRですよね?)本来はRTaseのネガティブコントロールをとりたいので、スタンダードもRNAである方が望ましいのですが、難しいことが多いのでDNAでスタンダードをとっています。 2検体間での発現量の比較定量をするのであればもっと気軽にddCt法がありますが、ウイルスの検出ということであれば絶対定量が望ましいので、スタンダードをおくしかないと思います。

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質問者からのお礼

ご回答ありがとうございます。 Applied Biosystemsのページを拝見させてもらいました。 DNAの濃度を測定し、計算によりDNA 1分子あたりの重量を求めることでコピー数を算出するということでよろしいでしょうか。 > スタンダードは増幅がかかるターゲットよりちょい広め(200bpくらい?)のPCR産物を精製 とありますが、具体的にはどのような手法で精製するのでしょうか? 人工合成ではなく、実際の系より広い範囲を増幅するプライマーを利用して、スタンダード用のPCR産物を精製しているということでしょうか? また、スタンダード作製には手元に陽性コントロールがないと無理でしょうか? ddCt法についても勉強させていただきます。 可能でしたら、補足説明していただけると幸いです。

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#1です。 >実際の系より広い範囲を増幅するプライマーを利用して、スタンダード用のPCR産物を精製しているということでしょうか? 仰る通りです。 ターゲットとなる配列を含む領域をPCR増幅し、それを簡単に精製(kitなどでカラム精製、脱プライマと脱塩)します。 この標準品を段階希釈系列にして、検体が収まる様なスタンダードカーブを描いています。 私は微生物系の研究者ですが、いまのところこれで文句を言われたことはありません。(mRNAの発現量の相対定量が主な目的だからかもしれませんが) RNAの検出が目的のようですが、陽性コントロールを得るのに一番手軽なのは、T7プロモーターを持つベクターにクローニングし、T7RNAポリメラーゼでRNAをつくる方法だと思います。

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質問者からのお礼

丁寧な解説ありがとうござました。 PCRやクローニングを利用して陽性コントロールを作製しているのですね。 これからも色々と勉強してみたいと思います。 やはり1度は陽性サンプルを手に入れないとダメですね。 周りに知識のある人がいなかったので、とても助かりました。

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