逆転写後に残ったプライマーは、あとのPCRに影響する？

質問

逆転写でRNAをｃDNAに変換する時、ランダムプライマーを使用する場合があると思います。この場合、その後の実験系（PCR、定量PCR）において、残っているこれらのプライマーによって非特異的なシグナルが増幅したり、ターゲットの遺伝子のシグナルに影響を与えたりすることがあるのでしょうか？
やはり、エタノール沈殿など行なってから次のPCRなどに移行するのが普通でしょうか？

どなたかご意見いただければ幸いです。
よろしくお願いいたします。

回答No.1

Chicago243 · ベストアンサー

RTを反応液そのままPCRに持っていってますが問題なくworkしてます。ランダムプライマーはそんなに長くないのでPCRのプライマーのアニーリング温度では高すぎると思います。
一般的にはそうであってもここのケースでどうなるかは別ですから気になるのであればランダムプライマーを除けるスピンカラムを使えばいいのではないでしょうか。またPCRのプライマーのながさをより長くすればランダムプライマーのミスアニーリングをより確実にへらせます。

お礼

ご回答ありがとうございます。
アニーリング温度に着目すると良いのですね。

回答No.2

geneticist12

ランダムプライマーを除去する必要はありません。
私が読んだ限りの文献でもそのようになっていますし、実際そうやって問題ありません。

RTにランダムプライマーを使うときは特異的プライマー、oligo dTプライマーより5倍程度高いmole濃度にしますが、それでも、PCRに持って行くときに希釈されるので、PCRプライマーと競合するような濃度にはなりません（ある種のone-tube systemはこの限りではありません）。

Tmもはるかに低いので（せいぜい室温程度）、PCRでは機能しないでしょう。

ちなみに、もしRT後にもう一手間加えるなら、RNaseHでRNAを消化しておく方が、良い結果に結びつくと思います。

お礼

ご回答ありがとうございました。
喉のつかえが取れてすっきり致しました。