- ベストアンサー
mRNAの定量をしたいと思うのですが
マウスプロラクチンレセプターmRNAを定量したいと思ってますがcompetitor RNAの作り方がよくわかりません。そのため、抽出したRNAを逆転写してPCRで増幅し、サザンブロットを用いて定量したいと考えています。もしこの実験に関して知っていることがありましたらどうか教えてください。お願いします。
- 生物学
- 回答数3
- ありがとう数2
- みんなの回答 （3）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
- ベストアンサー
王道はノーザンブロットのシグナルをデンシトメーターでバンドシグナル強度を測定し，ハウスキーピングとの割り算で値を出すこと． （プロラクチンのノーザンシグナル）÷（G3PDHのノーザンシグナル）の数字で棒グラフを書く． ２番目は半定量リアルタイムPCR．しかし機会がないとこれはできない． ３番目はご指摘の通りコンペティター入りRT-PCR．作り方は，制限酵素などでPCRプロダクトサイズがあまりにもマザーのサイズと変化しないようにデリーションすればいいんじゃないですかね（僕もよく知りません，すみません）． 「そのため」以下の案は，PCRしてしまったら，mRNA量にバイアスがかかる．1st strand 合成ののち，PCRしないでドットブロットするほうがいい． *しかし，それならなぜRNAのままドットブロットしませんか？ 逆転写することでRNAではなくなるから扱いやすくはなりますが，手順が入れば入るほど，もとのRNA量からかけ離れていきます．
その他の回答 (2)
- k9999
- ベストアンサー率31% (36/115)
#2さんの言うようにＲＴＰＣＲではだめですか？作業的にサザンよりラクに出来ますよ。
こんにちは。 ご質問でおっしゃるような方法では定量性はないと思いますよ。PCRをかけるとsaturateしますから、もとのtemplateの量を反映したシグナルは得られません。 その辺で売っている実験書を見れば、こういった実験の方法はいくらでも書いてあります。まずはそういったものをきっちり読んでみた方が良いと思いますよ。 やっぱり1番さんのおっしゃるようにNothernか、QC-PCRか、もし機械があるならばReal-Time PCRか、アレイでしょうか。やりかたは実験書を参考にするべし、です。頑張ってください！
関連するQ&A
- mRNAにおける遺伝子の発現について
遺伝子実験初心者です。 mRNAにおけるとある遺伝子の発現レベルを調べる実験を行おうとしています。 リアルタイムPCRを行える環境でないため、次のように実験を行おうと思っています。 RNAの抽出→RNA量の測定→RT-PCRでcDNAを作製→目的遺伝子のプライマー＆ハウスキーピング遺伝子のプライマーを用いてそれぞれPCRにて増幅→電気泳動にてバンドの濃さを確認。 Aの細胞集団(1×10の6乗個)から抽出したRNAと、Bの細胞集団(5×10の6乗個)から抽出したRNAにおける、とある遺伝子の発現を比較したいのですが、両細胞から抽出したRNAをAとBで同量になるようにして実験を行えば、正しい比較ができていると言えますか？
- ベストアンサー
- 生物学
- RNA(DNA) competitorの作製に関して
今回の実験でcompetitive PCRを使ってmRNAを定量したいと思っています。しかしこの実験で一番重要なcompetitor RNA(DNA)を作るときの注意点がいまいち分かりません。 お手数ですが、どうか教えてください。
- ベストアンサー
- 農学
- 逆転写後に残ったプライマーは、あとのPCRに影響する？
逆転写でRNAをｃDNAに変換する時、ランダムプライマーを使用する場合があると思います。この場合、その後の実験系（PCR、定量PCR）において、残っているこれらのプライマーによって非特異的なシグナルが増幅したり、ターゲットの遺伝子のシグナルに影響を与えたりすることがあるのでしょうか？ やはり、エタノール沈殿など行なってから次のPCRなどに移行するのが普通でしょうか？ どなたかご意見いただければ幸いです。 よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- ＲＴ－ＰＣＲ
RT-PCRでcDNAの作成を行っています 通常は、 RNA抽出物を逆転写して (polyA primerで) PCRへもっていっています。 しかし 先日ふと思い立って、 RNA抽出物を鋳型として そのままPCRしてみました。 すると、このRNA抽出物を鋳型としてPCRした場合も、 ｃDNAを鋳型とした時と同じ位置にバンドが出てきました。 このバンドは、鋳型RNAをRNAse Aで処理すると消えます。 このPCR産物の シークエンスをチェックしてみると、 目的遺伝子であることが確認できました。 （全長800bpの中の500bpのシークエンスを確認) RNA抽出キットはキアゲン社のものを使っています。 精製度が高いということなのでDNase処理は行っていません。 この場合、 RNAを鋳型として 目的遺伝子が増幅しているのでしょうか？ あるいは、 ゲノムDNAがコンタミが原因で イントロンを含んだものが増えているのでしょうか？ 通常、 DNA polはRNAを鋳型として 遺伝子増幅できないといわれていますが、 本当でしょうか？ 何か参考になる文献があれば 教えていただけないでしょうか？ よろしくお願いいたします。
- 締切済み
- 生物学
- Competitive （RT-） PCRについて
Competitive（RT-）PCRの原理は何とか理解したのですが、実際に定量実験をするときに、Competitorに具体的に何を使用して良いか分かりません。Competitorは市販されていて購入できるものなのでしょうか？ それとも自分で検討して、DNAなどを精製又は合成して加えるものなのでしょうか？ 合成オリゴなどを使用するのでしたら Competitorの選択基準など教えてください。またPrimerなどもTargetに特異的なもの以外で使用するのでしたら是非教えてください。 今現在、細胞由来のｍＲＮＡの定量をしたいと考えているのですがノーザン法では余りうまくいきません。是非よろしくお願いします _(,~,)_
- ベストアンサー
- 生物学
- 分光光度計によるRNA濃度定量
RT-PCRをするためｔRNAを抽出してサンプルを作製し、そのRNA濃度定量のため分光光度計を使用しています。スペクトル計測していますが山のピークが260nmでなく270nmくらいになってしまいます。原因として何が考えられるのでしょうか。なおRNA抽出はTRIzolで租抽出し（3層分離まで）その水層をスピンカラムにとおしてtRNA抽出しています。
- 締切済み
- 生物学
- RNA抽出
RT-PCRで、各組織でのRNA発現量の定量、比較を行っています このPCRのときに、RNA抽出物にDNAのコンタミがないかどうかチェックするためにネガコンとしてｃDNA作成に利用したRNA抽出物を一緒にPCRを行っているのですが このRNA抽出物（吸光度で濃度が1,9）にもｃDNAのものと同じ位置にバンドが出てしまいます PCRのプライマーは、イントロンを２ヶ所はさむように設計しているので、RNA抽出物にこのようなバンドが出てしまうのが理解に苦しんでいます RNA抽出キットはキアゲン社のものを使っています 精製度が高いということなのでDNase処理は行っていません 脳、肺ではこのRNA抽出物ではバンドが出ず、発現が高いと思われる肝臓でバンドが見られる（２回RNA抽出を行って2回とも）ので、このことも関係しているのでしょうか？？ このバンドがなくなるまで定量はできないのでしょうか？ アドバイスをいただけたら幸です
- ベストアンサー
- 生物学
- 現在マウスの胚盤胞からtotal RNAの精製→定量実験を行っています
現在マウスの胚盤胞からtotal RNAの精製→定量実験を行っています。 最終的にはマイクロアレイにかける予定です。 （数十個～100個近く集めるので、例えばsingle-cellを増幅するような特別な方法はとりません。） その定量が、今うまくいっておりません。 blastocyst 1個＝2 ngだそうなので、30個＝60 ngとして精製していますが、 微量専用の電気泳動で定量すると、数ngと出てしまいます。 brain total RNA60ngをcontolとして同様の処理を行うと、そちらは多少のロスがあるものの、 リーズナブルな量が定量できます。胚になるとどうもダメなようです。 リアルタイムPCRしても、やはり狙ったサイクル数より多くなってしまいました。 マウス胚は、IVFした後胚盤胞まで培養し、少量の培養液と共にエッペンチューブに移し、 すぐにTrizol 200ulを足してよくピペッティング→-80℃保存、という形で回収しています。 いつも培地からそのままエッペンに移しているので、 回収時にmineral oilが含まれているとダメかと思い、brainのサンプルをwith oilバージョンで 試したのですが、non-oil バージョンと収率は変わりませんでした。 哺乳類の胚あるいは卵からtotal RNAを精製し、定量したことのある方、 ご存知のことがあれば教えて頂ければと思います。 よろしくお願い致します。
- 締切済み
- 生物学
お礼
ありがとうございました。 これらを参考にして方法を考えたいと思います。