• ベストアンサー
  • すぐに回答を!

RNA(DNA) competitorの作製に関して

 今回の実験でcompetitive PCRを使ってmRNAを定量したいと思っています。しかしこの実験で一番重要なcompetitor RNA(DNA)を作るときの注意点がいまいち分かりません。  お手数ですが、どうか教えてください。

noname#4709
noname#4709

共感・応援の気持ちを伝えよう!

  • 農学
  • 回答数3
  • 閲覧数344
  • ありがとう数4

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
  • 回答No.3
  • robita
  • ベストアンサー率86% (13/15)

プライマーが Sense Primer:5'-Sp6 promoter-Target PrimerFor-Template PrimerFor Antisense Primer:5'-Target PrimerRev-Template PrimerRev となっていると思いますが、基本的にはTemplate PrimerのTm値付近にアニ-リング温度を設定すれば十分です。5'側に付加配列をつけてのPCRはよく行われることです。TaKaRaのCompetitor作成プロトコルではアニ-リング温度を60度としているのでまずはマニュアルにしたがってみて下さい。 ただ、今回のprimerは全体が45-60merとなっているので増やしにくいと予想されます。カラム精製の前に増幅産物の一部を取って電気泳動で確認して下さい。もし、増幅が確認できなかったり、増幅産物の長さがおかしいようであればPCRの条件を振る必要があると思います。 >一般的にプライマーの長さはどれくらいがよいのでしょうか? これはtarget primerの長さですか?一般には18-30merほど、できれば21-28mer程度が良いです。ただ、PCR(特にRT-PCRの場合)は増幅効率が良いprimerを用いることが大前提です。前回の回答に記入した通り、target primerに関しては予備実験を行うことをお勧めします。また、論文のマテメソにあるprimerを参考にしても増えないことがしばしばありますので注意してください。

共感・感謝の気持ちを伝えよう!

質問者からのお礼

本当にありがとうございました。それと自分のパソコンではないのですぐにお礼ができなくてすみませんでした。

その他の回答 (2)

  • 回答No.2
  • robita
  • ベストアンサー率86% (13/15)

Competitive PCRに関してはTaKaRa Bioのオンラインカタログには詳しく載っておりますね。 ただ、キットを使用しなくてもTemplate DNAをLambda DNAで代用するなりすれば、Competitorは簡単に自作できますよ。 TaKaRa社のプロトコルでは逆転写反応にRandom Primerを用いていますが、競合PCR時にはRandom Primerは良くないと書かれたプロトコル集もあるので注意をして下さい。それとキットではPCR産物を直接Sp6 polymeraseを用いてRNA competitorを作成していますが、後々の汎用性を考えるとpBluescriptなりのベクターに組み込んだほうが良いと思います。 もし、自分がこの実験系を計画するならば LinkerA-Primer1-LinkerB-Primer2-LinkerCなるcompetitorに対して(LinkerBはhetero-duplexを防ぐためにtargetと異なる配列を用いる場合)、Lambda DNAの一部をLinkerBに用いるため、[Target PrimerFor-Lambda DNA specific PrimerFor]、[Target PrimerRev-Lambda DNA specific PrimerRev]というprimerを用いてPCRをした産物をpBluescript (2)なり(この場合は制限酵素サイトを付加しておくと良い)、pGEM-T(-Easy)なりに組み込み、シークエンスを確認後、LinkerCとなる部分にPoly AまたはTargetの3'配列を組み込んで「Competitorのもと」としますがどうでしょうか? さらに補正目的でhousekeeping遺伝子と競合できるようにしておくと良いですね。(LinkerA-PrimerFor1-PrimerFor2-LinkerB-PrimerRev2-PrimerRev1-LinkerCとなるようにする。この場合LinkerC部分はpoly Aを入れる。) 説明が長くなって申し訳ありません。 >実験としてはtotal RNAの抽出までしか行ってません、なのでこれから先のことは実験したことがないです。 まず、最初の実験はTarget遺伝子を「効率よく」増幅できるプライマーを探すことからでしょうか?慣れればそれほど大変な操作ではありませんので、実験を頑張ってください。 分からないことがありましたら補足欄に書き込んでください。時間に余裕があるときにレスします。

共感・感謝の気持ちを伝えよう!

質問者からの補足

 とても丁寧に回答していただきありがとうございます。このTAKARAのキット(テンプレートDNA=λDNA)でRNA competitorを作製しようと思っているのですが、これの説明書を参考にしてデザインすると、センス,アンチセンスプライマーの長さがかなり異なったものになってしまいます。このような場合、どちらのTm値に合わしたほうがPCRがうまくいくのでしょうか?それと一般的にプライマーの長さはどれくらいがよいのでしょうか?お手数ですが宜しくお願いします。

  • 回答No.1
  • robita
  • ベストアンサー率86% (13/15)

hiro560127さん、こんにちは。 以前、マウスプロラクチン受容体の競合PCRをしたいといっていた件でしょうか? 回答前に少し、アドバイスと補足要求をさせてください。 以前の質問に対し、回答者の皆さんが競合PCRによる定量を反対されていましたが、競合PCRによる定量はその「利点」を理解して使用しなければ、「労多くして益少なし」な実験です。hiro560127さんが計画を立てている実験で、もし、その他の手段で定量可能であれば、そちらをお勧めします。(以上がアドバイスです。) 補足要求ですが、 1.hiro560127さんは、どれだけ分子生物学の実験を熟知していて経験がありますか? 2.実験は予備実験を含めてどこまですすんでいて、どこまでの回答がほしいのですか? 3.身近に今回の実験や分子生物学一般についてアドバイスをもらえるヒトがいますか? 詳しく補足をお願い致します。補足を頂かないとどこまで注意点を説明してよいか分からないのです。

共感・感謝の気持ちを伝えよう!

質問者からのお礼

 返事が遅れてすみません。 正直に言えば分子生物学の実験は今までに行ったことはありません(研究室内でも)。それとたまたまプロラクチンの定量に関しての参考文献がこの方法でやっていたからこの方法でやることにしました。それで様々な参考書を読んで自分なりにそれらを組み合わせて計画を立てました。最近になってTAKARA社のDNA competitor作製キットを用いて作る方向で話を進めています。実験としてはtotal RNAの抽出までしか行ってません、なのでこれから先のことは実験したことがないです。  こんな感じなのでこの方法以外の実験は詳しくは知りません。  robitaさんには本当に感謝しています。こんな事しかかけなくて本当にすみません。

関連するQ&A

  • mRNAの定量をしたいと思うのですが

     マウスプロラクチンレセプターmRNAを定量したいと思ってますがcompetitor RNAの作り方がよくわかりません。そのため、抽出したRNAを逆転写してPCRで増幅し、サザンブロットを用いて定量したいと考えています。もしこの実験に関して知っていることがありましたらどうか教えてください。お願いします。

  • Competitive (RT-) PCRについて

    Competitive(RT-)PCRの原理は何とか理解したのですが、実際に定量実験をするときに、Competitorに具体的に何を使用して良いか分かりません。Competitorは市販されていて購入できるものなのでしょうか? それとも自分で検討して、DNAなどを精製又は合成して加えるものなのでしょうか? 合成オリゴなどを使用するのでしたら Competitorの選択基準など教えてください。またPrimerなどもTargetに特異的なもの以外で使用するのでしたら是非教えてください。 今現在、細胞由来のmRNAの定量をしたいと考えているのですがノーザン法では余りうまくいきません。是非よろしくお願いします _(,~,)_

  • DNAとRNAの存在比

    大学の実験でウシの肝臓を使って、DNAとRNAの抽出と定量を行いました。実験結果ではDNAとRNAの存在比が1:2になりました。 この結果が正しいのかどうかを知りたいのですが・・・ DNAとRNAの存在比について分かる方がいらっしゃれば、教えてください。

  • DNAとDNAもしくはDNAとRNA

    漠然とした質問で申し訳ありません。 初心者なのですが、DNAとDNAもしくはDNAとRNAが結合するということを証明するような実験には何かあるでしょうか? 上司に探してみてといわれたのですが、ゲルシフトアッセイだと、DNAとタンパク質の結合をみているということになるため、少し実験が違うのではないかと思っています。 何かいいアドバイスお願いいたします。

  • RNAのバンドについて

    こんばんは。 実験で大腸菌DNAを抽出し、アガロースゲル電気泳動して撮影したところ、バンドが4本でました。 1番上がDNAによるもので、あと3つはRNAによるものだそうですが、その3つが、順にどのRNA(mRNA、rRNAなど)なのか、実験書などを調べたのですが特定できません。 ご存知の方、アドバイスをいただけないでしょうか。

  • RNA、DNAについて。

    自信がないので、正しいかどうか教えていただけますでしょうか。 正しいものを選ぶ問題です。 1.高等真核生物ではRNAのほとんどはtRNAではなくmRNAである。 2.高等真核生物では遺伝子の転写調節はcoding regionで行われることが多い。 3.DNAとRNAのヘテロダイマーは高等真核生物には存在しない。 4.高等真核生物のDNAは単鎖の分子として存在することが多い。 5.コドンは三つのヌクレオチドの配列で構成される。 自分の考え 1.RNAの細胞内での多さはrRNA>tRNA>mRNAなので、間違い。 2.転写調節は、coding regionよりも離れた場所から関与するので、間違い。 3.よく分からないのですが、チミンダイマーは存在するので、あると思い、間違い。 4.DNAは二本鎖なので、間違い。 5.その通りなので、正解。 三番はチミンダイマーはホモダイマーになるので、ヘテロダイマーとは言わないですし、ヘテロダイマーという現象はどのような時に起こるのでしょうか。 宜しくお願い致します。

  • PCRの原理とDNA/RNAの生合成の関連性

    今回、「DNAとRNAの生合成の違い」をふまえてPCR法を説明しなくてはならなくなったのですが、いまいちわかりません。 DNAとRNAの違いはリボースに付加しているモノがOHかHかということですよね? またRNAはリボヌクレオPCRはDNA断片を増幅する反応のことですよね。 RNAをPCRしたい場合は、cDNAに逆転酵素で変えてからPCRを行うと聞きました。チドの酵素による還元によってつくられますが、それとPCR法の原理とどのような関係があるのでしょうか???

  • RNA抽出

    RT-PCRで、各組織でのRNA発現量の定量、比較を行っています このPCRのときに、RNA抽出物にDNAのコンタミがないかどうかチェックするためにネガコンとしてcDNA作成に利用したRNA抽出物を一緒にPCRを行っているのですが このRNA抽出物(吸光度で濃度が1,9)にもcDNAのものと同じ位置にバンドが出てしまいます PCRのプライマーは、イントロンを2ヶ所はさむように設計しているので、RNA抽出物にこのようなバンドが出てしまうのが理解に苦しんでいます RNA抽出キットはキアゲン社のものを使っています 精製度が高いということなのでDNase処理は行っていません 脳、肺ではこのRNA抽出物ではバンドが出ず、発現が高いと思われる肝臓でバンドが見られる(2回RNA抽出を行って2回とも)ので、このことも関係しているのでしょうか?? このバンドがなくなるまで定量はできないのでしょうか? アドバイスをいただけたら幸です

  • DNAとRNAの違い(TがUになってる事ではない)

    RNAにはメッセンジャーRNA(mRNA)と転移RNA(tRNA)、そしてリボソームRNA(rRNA)があるそうですね。mRNAはDNAの情報を鋳方として核内で合成され、その遺伝情報を受け取って細胞質に移動し、リボソームと結合する(マイペディアより)……とありますが、要はRNAは全体としてDNAの情報を受け取ってそこからさまざまなタンパク質合成をしてるんですよね。 しかし、RNAは「リボ核酸」と和訳されるようにDNAと同じような核酸の塊ですよね。でも上記の話を考慮すると、DNAは設計図、RNAはつくる側、という気がします。この見解はあっていますか?あと、mRNAが持ってる遺伝情報をtRNAがリボソームへ持っていくときのその「遺伝情報」とはあくまでDNAの情報のことですよね? 紛らわしくていつもこんがらがります

  • DNAとRNAについて

    DNAとRNAについて 類似点と相違点を教えてください! 生化学の授業で問われました 馬鹿な大学生なので、わかりやすくかつ詳しく教えてくださるとありがたいですっ