RNA抽出

質問

RT-PCRで、各組織でのRNA発現量の定量、比較を行っています
このPCRのときに、RNA抽出物にDNAのコンタミがないかどうかチェックするためにネガコンとしてｃDNA作成に利用したRNA抽出物を一緒にPCRを行っているのですが
このRNA抽出物（吸光度で濃度が1,9）にもｃDNAのものと同じ位置にバンドが出てしまいます
PCRのプライマーは、イントロンを２ヶ所はさむように設計しているので、RNA抽出物にこのようなバンドが出てしまうのが理解に苦しんでいます
RNA抽出キットはキアゲン社のものを使っています
精製度が高いということなのでDNase処理は行っていません
脳、肺ではこのRNA抽出物ではバンドが出ず、発現が高いと思われる肝臓でバンドが見られる（２回RNA抽出を行って2回とも）ので、このことも関係しているのでしょうか？？
このバンドがなくなるまで定量はできないのでしょうか？
アドバイスをいただけたら幸です

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

単純なゲノムのコンタミなら、イントロンを含んだサイズが出るはずですから不思議ですよね。

できたら、そのPCR産物をシークエンスするなりして、ほんとうに目的のターゲットが増えているか確かめてみてください。たまたまサイズが似ている非特異的産物かもしれません。

また、ゲノムDNAそのものをPCRしたとき、どんな産物ができるのかも抑えておきましょう。それは、RTなしのときに出るバンドと同じでしょうか？塩基配列データからデザインした通りの結果が、実際に自分のサンプルで得られるとは限りません（ゲノム多型、配列データの間違い、非特異的増幅などのため）。

また、予想される長さより短いのが増えてきたというような場合、鋳型の乗換えが起こっている可能性があります。これは伸びきらなかった一本鎖DNAの末端にたまたま相補性があると対合して相手方の鎖を鋳型にして伸長が起き、これが投入したプライマーによって増幅することによっておこります。これもシークエンスしてみればわかりますね。

あと、これが本当にあり得るかどうかわかりませんが、レトロウィルス／トランスポゾンの逆転写酵素によって、生体内で実際にcDNAができていて、それが精製したRNAにコンタミしている、、、、とか？

現実的な対処としては、Qiagenで出しているRNeasy用のDNaseを試してみてはいかがでしょう。AmbionのカラムもQiagenと同等（かそれ以上）の性能ですので、変えてみるのもいいかもしれません。

これらのような、イオン交換マトリックスカラム方式は、もっともDNAの混入が少なく、信頼性の高い方法です。DNAのコンタミを極力ゼロにし、高い定量性を実現しなければならない、RT-PCRやマイクロアレイ解析には、この方法がグローバルスタンダードになっていると言っても過言ではないでしょう。一方、AGPC法では「原理的に」DNAを完全に除くは困難です。

回答No.1

dadachan

私も同じくキアゲンのキットを使って同様の結果を得た事があります。
原因はゲノムのコンタミンです。

キットを用いる場合には、その目的に合わせて用いるキットを変える、あるいは抽出方法を変える事をオススメします。

RNA発現量の定量・比較には、やはり純度の高いRNAを抽出する必要があります。その場合にオススメするのが、グアニジン法です。
グアニジン法では、RNaseの活性も抑制されますし、DNAも変性して混入を防ぐ事が出来ますし、組織には向いている方法だと思います。

古くからある方法ではあるのですが、やはり実験を行う限りは方法の原理をきちんと理解したうえで、目的にあった方法を選択するという癖をつける事をオススメします。

そうすればトラブルがあったときにも、トラブルの原因が考えやすいですよ。