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RT-PCR

RT-PCRでcDNAの作成を行っています 通常は、 RNA抽出物を逆転写して (polyA primerで) PCRへもっていっています。 しかし 先日ふと思い立って、 RNA抽出物を鋳型として そのままPCRしてみました。 すると、このRNA抽出物を鋳型としてPCRした場合も、 cDNAを鋳型とした時と同じ位置にバンドが出てきました。 このバンドは、鋳型RNAをRNAse Aで処理すると消えます。 このPCR産物の シークエンスをチェックしてみると、 目的遺伝子であることが確認できました。 (全長800bpの中の500bpのシークエンスを確認) RNA抽出キットはキアゲン社のものを使っています。 精製度が高いということなのでDNase処理は行っていません。 この場合、 RNAを鋳型として 目的遺伝子が増幅しているのでしょうか? あるいは、 ゲノムDNAがコンタミが原因で イントロンを含んだものが増えているのでしょうか? 通常、 DNA polはRNAを鋳型として 遺伝子増幅できないといわれていますが、 本当でしょうか? 何か参考になる文献があれば 教えていただけないでしょうか? よろしくお願いいたします。

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  • 生物学
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みんなの回答

  • 回答No.3
  • otx
  • ベストアンサー率44% (256/576)

>DNA polは 何故RNAを鋳型とすることができないのでしょうか? 酵素の性質については、 どういう酵素活性を持っているかということを試した結果 そういう酵素活性を持っている酵素だったということなので 「なぜ」ということに関しては誰もわからないと思います。 Tthはそもそも逆転写からPCRを行うことができる酵素ですので、 ここで論じるのは意味が無いと思われます。 そして、現場の話として、 質問者様のような現象が起こったとして、 TaqやDNAポリメラーゼで逆転写できるということ疑うほど 実用の活性を持っているとは現場の者は思っていないと思います。 それを新しい発見といえばひていはできませんが、 現場で頻繁に起こることではないです、経験上。 逆転写活性を持っているかもと考えるのは自由ですが、 他の溶液によるコンタミがあるとか、先にも言いましたが、RNaseにDNaseのコンタミがあるとか、一度関係溶液などを刷新すると再現できないとか、コンタミの可能性のほうが高いと思いますので、 まずは難しく論文を探すということよりも コンタミを撲滅しきってみてやってみてからでも遅くはないと思います。

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  • 回答No.2
noname#91223
noname#91223

次の記述を見つけました。 https://www.roche-applied-science.com/pack-insert/1480014a.pdf In the presence of Manganese (Mn)-ions Tth DNA Polymerase has a very efficient intrinsic reverse transcriptase (RT) activity (5), which is much higher than the activity reported for E. coli DNA polymerase (6) and Taq DNA polymerase (7). これによると、Tth pol.には高いRT活性が、Taq pol.にもいくらかのRT活性があるようですね。ご興味がおありでしたら、上記サイトに記載されている引用文献をご参照ください。 なお、ゲノムDNAが増幅している可能性をイントロンの有無で確認なさるのであれば、当該遺伝子の偽遺伝子(processed pseudogene)がゲノム中に存在しないという前提条件が必要です。

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  • 回答No.1
  • otx
  • ベストアンサー率44% (256/576)

ゲノムDNAがコンタミが原因だと思います。 まず、その使われたRNaseはDNaseを不活性化して無い可能性。 増幅する領域に必ずしもイントロンがあるとは限らない。 ということが原因ではないでしょうか。

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質問者からの補足

回答ありがとうございます。 増幅領域には、 イントロンがあることがわかっています。 DNA polは 何故RNAを鋳型とすることができないのでしょうか? これに関する論文があれば 教えていただけないでしょうか?

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