リアルタイムPCRの相対定量について

質問

初めまして。
最近リアルタイムPCRをするようになった初心者です。
主に実験では内部標準を用いた相対定量を行っているのですが、疑問があります。

よくネットでリアルタイムのプロトコルを見てると、複数の組織からRNAを精製し
cDNAを合成した後に、一種類のプライマーで一つの遺伝子の発現をそれぞれの組織で比較している例があったのですが、逆に一つの組織からcDNAを合成し、それをTemplateとして複数のプライマーで複数の遺伝子の発現を見ることは可能なのでしょうか？

またその際に、内部標準はサンプル分だけ準備しないといけないのでしょうか？
例えば、サンプル3つだったら、それぞれに対応する内部標準(actinとか…)3つと言った感じのでしょうか？

3サンプルあったとしたら、内部標準1サンプルではダメなのですか?
計算の時に内部標準のct値をそれぞれのサンプルから引けばよいような気がします。

研究室では新規にリアルタイムの系を立ち上げたため、まだよくわからないことだらけですので、ご教授いただければ幸いです。
よろしくお願いいたします。

回答No.1

noname#250373

>一つの組織からcDNAを合成し、それをTemplateとして複数のプライマーで複数の遺伝子の発現を見ることは可能なのでしょうか？

可能です。その場合、個別の遺伝子に対応したプライマーではなく、ランダムプライマーなどで調整したcDNAを使用します。

>3サンプルあったとしたら、内部標準1サンプルではダメなのですか?

内部標準はサンプルにつき１つ必要です。検証する遺伝子につき１つずつ用意する必要はありません。
例：
サンプルA:遺伝子a,遺伝子b…内部標準(actinなど)
サンプルB:遺伝子a,遺伝子b…内部標準(actinなど)
サンプルC:遺伝子a,遺伝子b…内部標準(actinなど)

>計算の時に内部標準のct値をそれぞれのサンプルから引けばよいような気がします。

基本的にはその通りです。ただし、各遺伝子のリアルタイムPCRの増幅効率がほぼ同一である必要があります。
これを回避するためには、Ct値での単純計算ではなく、各遺伝子ごとに濃度既知のスタンダードを用意し、検量線を作成して定量する方法があります。