組換え遺伝子の抽出、PCRについて

質問

組換え遺伝子について実験を始めたばかりのものです。組換え大豆の標品から組換え遺伝子と、大豆由来のレクチン遺伝子を検出しようと試みました。2ヶ月前には両方の遺伝子がPCRで増幅できましたが、再度同じ条件でPCRをしたところ、レクチンのみが増幅でき、組換え遺伝子は増幅できなくなってしまいました。この原因をずっと考えていますが、全くわかりません。どなたか良いアドバイスをお願いします。ちなみにプライマーなどには問題がありませんでした。

回答No.1

Grace-Wonder · ベストアンサー

PCRによって増えない原因はなにか？まず、問題点を整理すべきです。

　鋳型は、mRNA由来のcDNAを用いているか、genomic DNAを用いているのかにも寄って考え方は異なってきます。
前者の場合、転写が抑制されている可能性が考えられます。ノーザン解析などでもcheckされてみては？
後者の場合、genomic DNAから該遺伝子が欠失していたり、バックミューテーションがかかっていたりする可能性を考えなえればなりません。
目的遺伝子がクローニングしてある物なら、そのDNA断片を標識して、制限酵素で処理したゲノムDNAのサザン解析をお勧めします。
そうすることで目的遺伝子が染色体から完全に居なくなったのか、一部破壊されたのか、まだ存在しているのか、はっきりすると思います。

発現させるタンパク質が、その細胞にとってtoxicであったり、成長を遅らせるような物であった場合、その遺伝子をもっていない（壊れている）細胞だけが、持っている細胞に比べて増殖速度が速いために、形質が現れないことがありえます。

以上ご参考になれば幸いです。