大腸菌からの直接PCRについて

質問

僕は大学の研究室でクリスマスローズという花の種特異的なDNAマーカーについて研究しています。その実験の過程で質問があります。
　葉から抽出したDNAをオペロン社のプライマーOPA01～20までを用いて多型検索した結果いくつかの種特異的なバンドが得られました。それを大腸菌を用いてクローニングし、目的断片の確認のためコロニーPCRを行いましたが、その結果わずかながらサイズに差のあるバンドが数種類検出されたため、どのバンドが目的のものかを特定することができずに困っています。自分としては、大腸菌から直接OPAプライマーを用いてPCRを行えば、目的バンドがあればそれが増幅されるのではないかと考え、PCR組成、反応条件を変えて実験しています。しかしうまくいきません。もしこのような実験を経験したことがありましたら、PCR反応液の組成、反応条件などアドバイス下さい。その他にもなんかアドバイスありましたらぜひ頂きたいです。お願いします。

回答No.3

kaazuu

状況がつかめないのですが、「いくつかの種特異的バンドをクローニングした」とありますが、
つまり、PCRによって何本かのバンドがでてきたそれらを丸ごとクローニングしたということですか？それともゲル抽出して、一本一本をクローニングしたのですか？

違うかもしれないですが、たとえば、PCRで得られたバンド一本をゲル抽出して、プローブ化し、コロニーPCR産物にサザンハイブリダイゼーションするとかはどうでしょう。めんどうかな。

回答No.2

geneticist12

＃１です。
うっかり、文の一部を消してしまっていたみたいで、意味不明でしたね。訂正します。

最もありそうなのは、非特異的増幅が起こっていて、それをクローニングしてしまった可能性でしょう。インサートの末端だけでもシークエンスするのが一番だと思います。

回答No.1

geneticist12

目的のものがうまくクローニングされているとしたら、PCRで増えてこないということはまず無いと思います。ゲノムから増幅できて、同じプライマーで大腸菌クローンから増幅できないというのは解せません。そもそも、サイズの異なるPCR産物が入り混じっているというのがあやしい。
最もありそうなのは、非特異的増幅が起こっていて、それをクローニングしインサートの末端だけでもシークエンスするのが一番だと思います。