コロニーPCRについて

質問

基礎的なことですいません。生物実験についてなのですが、以下のような手順を用います。

形質転換した大腸菌をプレートで培養⇨生えたコロニーのPCR、バンドを確認⇨生えたコロニーを溶液培養⇨大腸菌液からプラスミド抽出

ここで質問なのですが、コロニーPCRからは目的バンドを確認できるのに、いざ溶液培養を行い、プラスミド抽出後にPCRを行うと、目的バンドでない事が多々あります。この場合には、コロニーPCR溶液について溶液培養を行えばいいのでしょうか？
ちなみに、コロニーPCRを行ったコロニーと、溶液培養を行うコロニーは同じコロニーではなく、それぞれプレートからピックアップしたものです。

またもう一つ質問なのですが、溶液培養を行うコロニーは一粒でいいのでしょうか？自分が用いている大腸菌がDH5αで、コロニーが非常に小さいので、オーバーナイトで増殖するのか心配です。

回答No.2

browntraut · ベストアンサー

コロニーを20ulのLBリキッドに懸濁し、1ulをテンプレートとしてコロニーPCRを実施します。

目的のバンドが得られれば（当たりであれば）、残り19ulを種として数mlの液体培養を開始します。

ミニプレップ後のプラスミドは、コロニーPCRと同じものですので、PCRでは同じバンドが得られるでしょう。

エキストラが得られるなら、DNAがクルードでなくなったため、プライマーがアプローチしやすくなったからでしょう。

プライマーを適切なものに変えれば、キレイに出る筈です。

お礼

回答ありがとうございますo(^▽^)o
コロニーPCRを行う前にLB培地溶液に懸濁させるわけですね！試してみます。

回答No.4

noname#250373

２つ目の質問で気付くべきでしたし
No.2, No.3の方の回答を見ていて思ったのですが…

もしかして質問者さんは
「プレート上のコロニーはみんな同じ。そのうちの１個が当たりなら他のも当たり」
と思われていたのでしょうか？
それは違います。個々の大腸菌には当たりのクローンもいればハズレのものもあります。
それらを分離するためにプレートに巻いているのです。
ぱっと見当たりのクローン同士でも混ぜて使わないのがルールです（未確認のエラーがあるかも知れないので）。
「それくらいは知っている」ということでしたらごめんなさい。

経験者がいるのなら事前に実験方法を相談し、
頼れる人がいなければもっと事前に勉強しないと
時間とお金と労力が無駄になってしまいますよ^-^;
「バイオ実験イラストレイテッド」あたりは押さえておいた方がいいかもです。

お礼

回答ありがとうございます。コロニー毎に別々のプラスミドを持つ可能性があるのは知ってましたが、コロニーPCRで当たりだったコロニーを、そのまま溶液培養に持っていく方法がわからなかったので、質問させていただいた次第でございます。

回答No.3

otx

>またもう一つ質問なのですが、溶液培養を行うコロニーは一粒でいいのでしょうか？
自分が用いている大腸菌がDH5αで、コロニーが非常に小さいので、オーバーナイトで増殖するのか心配です。

大腸菌を使った遺伝子のクローニング作業において、
基本というか作業の意味を理解されているとは思えません。

そのような文章を見てしまうと、他のことについてコメントしても
付け焼き刃の知識を提供するだけであり、結果として
質問者さんのためにならないと、私は心配します。

質問者さんの周りには、先輩，先生はいませんか？
実際にきちんと教えを乞いましょう。

また、巷には様々なな実験書籍があります。
きちんと基本を押さえることが重要だと思います。

このような会社から書籍は出ています。
http://www.yodosha.co.jp/
http://gakken-mesh.co.jp/

ネットは参考までに、実際に習うことが重要です。

回答No.1

noname#250373

１つ目の質問ですが、コロニーのピックアップ方法に問題はありません。
PCR溶液から培養を開始するのは、あまり見かけません。
PCR反応前で、なおかつバッファーに界面活性剤が入っていなければ培養できるかもしれませんが。
通常は「コロニーのピックアップ」→「レプリカ用のプレートに植菌」→「PCR溶液へ」の順ですから。

当たりのプラスミドがうまく取れない対策は以下の通りです。
・できればプライマーの１方をベクター配列に、もう１方をインサート配列にする
（プレート上の大腸菌に入らなかった非組み換えDNAからの増幅を排除するため）
・テンプレートなしのネガコンPCRを一緒に行う（コンタミの可能性を排除するため）
・必要以上にPCRサイクル数を増やさない（ノンスペバンドの誤認を防ぐため）

２つ目の質問ですが、２粒拾ってはいけません。それぞれ別のクローンですから。
コロニーが非常に小さいというのがよく分かりませんが、1mm以下のコロニーでも十分です。

お礼

回答ありがとうございますo(^▽^)o