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RT-PCRについて
RT-PCRの質問です。 RNAからcDNAに逆転写するときに、Randam Primerと いうものがありますが、これってランダムにRNAに くっつくのですよね？だからいろんな長さのcDNAが できてしまうと思うのですが、Randam Primerを使っても 大丈夫でしょうか？Randam Primerの他に、オリゴdT Primer というのもありますが、どっちが逆転写に良いのでしょうか？ あと、cDNAを増幅させるときのPCRで、遺伝子特異的な プライマーを使おうと思うのですが、１つのサンプルに センスとアンチセンスのプライマーを混ぜても大丈夫 なのでしょうか？あらかじめセンスとアンチセンスを 等量混ぜたプライマー液を作っといて、反応液に混ぜれば 良いのでしょうか？
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#3です。 オリゴdTはmRNAにつけられるpolyA tailに結合します。 mRNAが持っているものですので、効率よく全長のcDNAを作製するとき、つまりcDNAライブラリーなどに使用される他、cDNAの3'側にPCRのprimerが設計されている場合には、mRNA特異的ということもあってRT-PCRにも有効ですが、まえのかたも書かれていますが、cDNAの全長がながく、しかも5'よりにprimerのsetが設計されている場合には増幅効率に影響しますので注意してください。 primerのミックスは作製しておいて良いですが、凍結融解を繰り返す場合には分注しておいたほうがいいのと、合成したすべてのprimerをまぜうようなことはしないほうが無難です。ときどき、こんなprimerはRT-PCRにしかつかわないからといって調子に乗って全部まぜる愚か者がおりますが、片方のprimerがひつような場合など多々ありますので、一部小分けしてミックスして、さらに分注して保存しておくのは便利だと思います。
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- Dr_Hyper
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学生に指導するときには、Randam primerとoligo dT primerの特性を説明し、自分が用意した実験計画に合わせてRT反応をさせます。一般にはRT PCRにはrandam primerの方が使いやすいと思いますが、azwagon2さんの具体的な実験計画がわかればもうすこし詳しくご説明できるかと思います。 2番目のご質問は、RT反応をした後のPCRということでしょうか。 であれば、混ぜてPCR反応を行ってください。両方入れることで増幅が可能です。RT反応にも入っていてかまいませんが、バックグラウンドで非特異的なものが増えてしまう可能性が高くなるので、アンチセンスのみでRT反応はした方がいいですね。 お答えになりましたでしょうか？
お礼
ありがとうございます。どうも一般的にRandam Primerの方が 使われてるみたいですね。 私の実験目的は、細胞の薬剤処理有無で目的の遺伝子発現に どれだけ影響するか調べる実験です。 ごく当たり前にやられてる実験なので、randam primerを使った 方が無難な気がしてきました。ちなみにoligo dT primerとは どのようなプライマーなのでしょうか？cDNAのどの辺にくっつく のでしょうか？？ ２つ目の質問は、RT反応後のPCRです。両方のプライマーを いれて増幅可能なんですね！！てことは、２つのプライマーを 混ぜて持っておいてよいのでしょうかね？？ また宜しければ教えてください。
- tunertune
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ある程度ものが分かっているならSpecific primerという手もありますよ。10kbくらいなら頭と5kbくらいのを混ぜて逆転写すれば全部をカバーできると思います。 ２の質問は、 ＰＣＲの時にfowardとreverseをいちいち混ぜるのでは無く、あらかじめ混ぜたものをストックとしておくという意味ですよね。 やったことがないので分かりませんが、多分問題ないと思いますよ。 よほどそのフラグメントを数増やすのであれば別ですが、混ぜるのはもったいないと思いますよ。他の事には使えなくなりますし・・・。
お礼
確かにSpecific Primerを使う手もあるってのを プロトコール集で調べてみたらのってました！！ ２つ目の質問は、tunertuneさんがおっしゃる通り です。混ぜるとたしかに他のことには使えなくなり ますね。
- tatoo
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１つめの質問についてですが Randam primerとoligo dT primerでは使用する目的が若干異なります。ごくごく簡単にですが、それらの長所と短所を挙げてみます。 Randam primer 長所；サイズが大きいRNAの5'側のcDNAを得やすい 短所；全長cDNAを得にくい oligo dT primer 長所；全長cDNAを得やすい 短所；サイズが大きいRNAの5'側のcDNAを得にくい PCRで増幅する場所が10kbのRNAの最も5'側である場合、oligo dT primerでRTをしたtempleteではPCRがうまくいかないことがあります。あなたがおっしゃるととおり、Randam primerではいろんな所にアニーリングしていろんな長さのcDNAができるので、それが利点となって上記の問題が解決する場合があります。その辺の事を考慮に入れて実験を行えばいいのではないでしょうか？ ２つ目の質問は。。。。書いてある事がよくわかりません（汗 PCRの原理についてもうちょと勉強してみてはいかがでしょうか？
お礼
教えて頂き、ありがとうございます。 Randam Primerとoligo dT primerとでは 目的がかわってくるのですね。oligo dTだと サイズが大きいRNAの5'側が得られにくいなら、 Randam Primerの方が良い気がしてきました。 ２つ目の質問は、RTの後のPCR反応で、プライマーを 入れる時、あらかじめセンスとアンチセンスの プライマーを混ぜておいたチューブを作っておいた 方がいいかなと思っただけなんです; わかりずらい質問で申し訳ないです。
お礼
素早い対応ありがとうございます。 なるほど～oligo dT primerはpoly Aに結合 するのですね。だからmRNA specificなプライマー なんですね。cDNAの全長が長いと増幅効率も変わる そうなので、気をつけたいと思います。 primerのMixは、少量を分注しておこうと思います。 さすがに全部を混ぜる勇気はありません…。どこでまた 必要になるかわからないですからね！ とても勉強になりました。専門誌とかも読んでもっと 勉強しようと思います。ありがとうございました。