DNAの安定性について

質問

シークエンス解析をしています。対象は、ゲノムをテンプレートとして増幅したDNA断片（PCR産物）をエタ沈したサンプルです。解析の結果を見ると、増幅時のプライマーが残っているのか、ノイズが多くてきれいに読めませんでした。エタ沈の条件を変えたりしたのですが、あまり効果はありませんでした。市販の精製キットでは少し効果があるようでした。ところが、３週間ほど冷蔵保存したPCR産物で解析したところ、以前の精製条件でも、ノイズが減ってきれいに読めるようになりました。そこで質問なのですが、冷蔵あるいは長期保存することでサンプルがきれいになって（例えばプライマーが分解して）、シークエンスがうまくいくというようなことがあるのでしょうか？

回答No.3

noname#91223 · ベストアンサー

>例えばプライマーが分解して

という理由でシーケンスがうまくいくということは無いんじゃないかなあという気がします（例えばＰＣＲのプライマーが分解していれば増幅産物も分解しているでしょうから）。

可能性の一部として敢えて挙げるとすれば、例えば３週間前とは精製やシーケンス反応に用いた試薬やバッファーのロットが違う、前回は単に精製や反応の操作が失敗していた、等々。

原因を追及しようと思えばそのためのコントロール実験を行う必要がありますが、結局原因は分からないということも有り得ます。私も特定の制限酵素がどうしても効かなかった時期があって、考えられる限りの可能性を追求していろいろコントロール実験をしてみたことがありますが、結局原因は分からず、あきらめて別のことをやっているうちに何故かうまくいくようになったことがあります。はっきり言って実験ってそういうことが多いです。日頃頑張って実験しているご褒美だと思っておけばいいと思います。

もちろん事実は事実ですから、その背景になにか原因があることは間違い有りませんが・・。

回答No.2

otx

＞冷蔵あるいは長期保存することでサンプルがきれいになって（例えばプライマーが分解して）、シークエンスがうまくいくというようなことがあるのでしょうか？

経験無いです。
理論的に言えば、プライマーが優先的に分解するという理由が無いように思います。分解、または蛍光（？）が減退するような状況だったら、同じようにDNA断片のシグナルも相関して落ちるのではないでしょうか。

どのようなシステムでシーケンスされているいるかわかりませんが、
産物を流すときに使用するゲルの状態、機械のメンテナンスの状態など、
他に結果に影響するファクターがあると思います。

回答No.1

umetoshiso

1年ちょっとシークエンス解析していますが、保存期間で差を感じたことはないです。最近半年前のサンプル（-20℃保存）をシーケンサーにかけましたが、べつに変わったところはなかったです。プライマーも3週間冷蔵庫に入れたところで分解しないと思います。数ヶ月前のプライマーでも使えているので…。

同じ日、同じサンプル、同じ条件でもなぜかノイズが出るものとあまり出ないものがあったりします。どの段階が影響しているのかわかりませんが、努力ではカバーしきれない「運」のようなものもある気がします。

ノイズの原因は目的の遺伝子以外が混ざっている可能性が高いと思います。nestプライマーでもう一度PCRしてみるとか、ＴＡクローニングを試したほうが解決策としては確実だと思います。