シークエンス解析

質問

実験初心者でして分かりにくい質問であったなら申し訳ありません。大変初歩的な質問で恐縮です。
現在癌細胞を用いてシークエンスを行っています（ABI310）。PCRmixを作り、PCRをかけてDNAの増幅を確認して、その後PCR産物を100倍希釈してテンプレートDNAを作りプレミックス、プライマー、SDWを加えもう一度PCRをかけて、できたシークエンスPCR産物を精製しシークエンサーにかけ塩基配列を読み取る方法です。一回目のPCRではバンドは大変はっきりと見え増幅が確認できるのですが、シークエンサーで結果を見ると4色蛍光のうち、赤（T）のみほぼ真っ直ぐな波形でわずかにクネクネと山型をなしており、きれいな山型が出ません。他の3色についてはピークはそう高くはないのですが塩基配列は一応読み取れます。何度精製を念入りに行っても同じ結果で困っています。アドバイス頂ければ有難いです。

回答No.1

noname#160718

同じラボの先輩や先生に聞いた方が早いとは思うのですが・・・

　ご質問の状況だと、私ならまず最初にサイクルシークエンスに使用している酵素キットを疑います。別のキットを使って試してみれば判明すると思います。

　それよりご質問にあったプロトコルで少し不可解なところがあるのですが、まずPCR産物を100倍希釈している理由は何でしょうか。
　私の経験では、PCR産物のダイレクトシークエンスでシークエンスに支障があるほどの産物量がPCRで増幅されたことがあまりないものですから、100倍希釈するというプロトコルがよく判らないです。
　よしんば、PCR産物のDNA量が多すぎるのだとしても、それはPCR産物の精製後にDNA量を測定して調節すればいいだけのことのように思えるのですが・・・

　それと上でも触れましたが、PCR産物を精製せずにサイクルシークエンス反応を行っているのでしょうか。
　ごく基本的なダイレクトシークエンスの手順は、
１．PCR産物の精製
２．電気泳動等によって精製したDNA量を測定して濃度調節
３．サイクルシークエンス
４．サイクルシークエンス反応物の精製
５．シークエンサ
　となると思うのですが。
　PCR産物を精製せずにサイクルシークエンスをやれば、テンプレートにプライマーやdNTPが残っているので上手くいくはずがない、と思います。
　もしかしたら精製の代わりに100倍希釈しているのでしょうかね？

　このプロトコルが、質問者さんのラボで以前から行われている方法なのでしたら、それこそ先輩なり先生にその意味は聞いておいた方が良いとは思います。