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シークエンスでプライマー配列部分の塩基は決定可能？
PCR産物をダイレクトシークエンスする場合、塩基が決定できるのはプライマーで挟まれた部分の配列についてで、プライマーがアニールするはずの部分（プライマー配列に含まれる部分）の塩基は決定できないという認識でいるのですが、正しいでしょうか？ 実は、最近読んだ国際誌（Molecular Ecology）の論文で、（そのPCRに利用したと明記されている）プライマーがアニールするはずの部分の塩基を決定し、そこにたくさんの多型（全多型の約20%）を検出しているのをみて不思議に思った次第です（GenBankにも同様の配列が登録されていました）。 プライマー配列部分にプライマーと異なる塩基があれば、その部分がヘテロのピークとして現れることがあるとは思うのですが、このようにして得られた塩基は信用していいのでしょうか？また、ヘテロが現れなったからといって、その部分の対象の配列がプライマーと同一としていいのでしょうか？ メジャーどころの国際誌に出ているのだから問題ないと思わないでもないのですが、配列のローデータにまであたらないと分からないわけですから、見落されていたということもありえると思うのです。 ご意見のほどお聞かせいただければ幸いです。 どうぞよろしくお願いします。
- albbone75
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プライマーの結合部位の下流でなければ、 通常はダイターミネーター法とダイプライマー法ではプライマー上の塩基配列を決定することが出来ません。 もしかしたら、3'側の末端の塩基を変える事により読めなくなるかどうかで調べることが出来るかもしれません。 どの論文なのかはわかりませんが、 歩いていたりしていて、そこのSNPsの検出にはさらに外側のプライマーを使っていませんか？
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- planta
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うーん。 論文書く時にプライマーを間違えてしまったと考えるのが いちばん自然かもしれませんね。何か特別な実験系を適用 したのであれば、その旨明記するでしょうし。
お礼
どうもありがとうございます。 その可能性については、執筆者に確認してみるしかないですね。。。
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