シークエンスと分子量マーカー

質問

PCR産物をアガロース電気泳動とシークエンスにかけたのですが。
電気泳動のバンドは690bp程度のところに出たのですが、シークエンスの結果は640bpでした。どっちが正しいのでしょう？

・プライマーの設計時には690bp前後を想定していました。
・シークエンス結果はGene Bankで参照したところ、目的の配列とその長さのなかで一致しました。
・プライマー配列は含まれていました(ただしやけに相同性が低い)

すみませんこれだけで情報が十分かどうかはわかりませんがお願いします。

回答No.3

ebikichi · ベストアンサー

お使いのシークエンサーは何bまで読めます？
せいぜい600くらいでは？
690だと途中にプライマーを設計してもう一回読む必要がありませんか？
波形を見てください。最後の方はショボショボではありませんか？

補足

またまた、ご指摘ありがとうございます。

すみません書き忘れましたが、シークエンスは今回のデータでは外注しました。そのせいで手ごたえがなくて、、、。
シグナルをもう一度確認してみます。

回答No.2

geneticist12

アガロース塩基泳動が適切におこなわれていて、690 bpと640 bpなら区別をつけることが出来る、という前提で、

まず第一に、シークエンス反応で鋳型の全長が読めるとは必ずしも限らないです。読み始め、読み終わりのノイズの高いところシグナルの低いところはカットされているかもしれません。

それと、両側鎖（両方向）それぞれシークエンスしてつきあわせた結果が640 bpだったのでしょうか。片側しか読んでいないのなら、原理的にプライマーより先の塩基からラダーが現れ、プライマー自体の配列はラダーに現れませんので、読める配列は鋳型の長さより短くなります（いわれなくてもわかっているよっ、てことだと思いますが）。

補足

回答ありがとうございます。
両側鎖付き合わせました、それで双方向のプライマー配列もあわせてカウントしたのですが、、、。

電気泳動関連の問題なのかもしれません。

回答No.1

tunertune

泳動時のゲルの濃度はどのくらいですか？
薄いゲルを使った場合50bpの違いというのは
たいした違いではないように思います。
あと、DNAの形によって流れ方もかわってくるので。
ポジティブコントロールとかが使える実験ならば
比べてみるのがいいと思います。

補足

早速の回答ありがとうございます。
ゲル濃度は1.5パーセントです。
薄めですかね。
50bp位誤差の範囲となると、やはりシークエンスのほうが正しいのかな。