２段階PCRについて

質問

少々汚いDNAを鋳型に用いてPCRをしています。
増えが悪いときに、PCR産物を鋳型に同じプライマーを用いて２段階PCRをすることで、ほとんどのサンプルが増幅してくれます。
それで、この結果を元に論文を書こうと思っているのですが、なぜ２段階PCRをすることでPCRの結果が改善するのかという引用文献が見つけられません。
２段階PCRは感度が良いと言われていますが、そうきちんと書いてある文献や、なぜ感度がよいのかを書いてある（議論している）文献をご存じの方、教えていただけませんでしょうか。

回答No.5

mizu_atsu

＞ただ、その汚染物質の特定も出来ていませんし、濃度もわかりません。そこで、たぶんその答えは当たりだと思うのですが、推論の域を出ていないので、同じような議論をしている論部を引用文献として探しているのです。

そのような論文を探したことはありませんが、あまりないような気がします。仮にあったとしてもそれが貴殿の論文に使えるかも疑問です。そもそも何が邪魔をしているかわからない状態です。そしてそれは複数あるかもしれません。ある生物では○○が、そして違うある種では□□が関与しているかもしれません。実際のところは実験的に予想する汚染物質をピュアなサンプルに混ぜてやってみないと答えはでないと思われます。
そしてそんなことをやっている位なら全部のサンプルを精製した方が速いのでは？とも思ってしまいます。
そうすれば増える増えないの議論はいらないですし。
また、そもそもその部分（1回で増える増えない）は今回の論文の主旨なのでしょうか？違うのであればそんなにやっきなって参考文献を捜す必要も議論する必要もないような気がしますが。。。

回答No.4

cooh

PCR法そのものについての論文でないのであれば詳しい引用は特に必要ない気もしますが…

同じ方法でDNAを調整したにも関わらず、サンプルAは一度のPCRで増幅され、サンプルBは二回行わないと増幅されなかった。なので、Bに含まれるtemplateの量は、Aより少ないだろう、
単純に考えればこうだと思いますが…どうでしょう？

補足

サンプルＡとＢとでDNA抽出液自体のmupidでのバンドの濃さに大きな違いはないので、サンプルBのtemplate量がサンプルAに比べて少ないと言うことは無いと思います。
下のNo3のに現在考えている内容を補足として書き込んであるので、またコメントをいただければと思います。
よろしくおねがいします。

回答No.3

mizu_atsu

＞あくまで「なぜ１回で増えないものが２回で増えるか」ということを議論したいと考えているのです。

そもそも元となるDNAが少々汚いのですよね？
であれば、その汚いなにかがPCRの邪魔をしているのではないですか？
そのため1回目はあまり増えない。
だが、2回目はその汚染物の濃度が下っているから増幅する。
ただそれだけのような気がしますがいかがでしょう？？

1回目でかなり増幅する、しないは最初の汚染具合の差が出ているのではないでしょうか？

補足

コメントありがとうございます。
まさにそのように考えています。
ただ、その汚染物質の特定も出来ていませんし、濃度もわかりません。
そこで、たぶんその答えは当たりだと思うのですが、推論の域を出ていないので、同じような議論をしている論部を引用文献として探しているのです。
何かご存じでしたらよろしくおねがいします。

回答No.2

tanuki81

ええっと、一回目のＰＣＲで非常に少なかった鋳型が増幅され、二回目にそれを鋳型にするからサンプルの増幅が確認されるためですよね。しかも、同じプライマーを用いているため、二回目に非特異的な増幅産物が出る可能性も少ない…。これに参考文献が必要なのでしょうか？なくても良いような気もしますが…。

バイオ実験イラストレイテッドの３ 本当に増えるＰＣＲに鋳型ＤＮＡ量のことや、調整法が載っていますからこれを参考に考えた、と書けばよろしいのでは？

補足

１回目のPCRだけで増幅できるサンプルと２回行わないと増幅できないサンプルとがあるので、その違いについて議論を展開しています。そのため、参考文献が必要となってきます。
バイオ実験イラストレイテッドなどはもちろん参考にしていますが、英語論文のため日本語の本は引用したくないことと、あくまで「なぜ１回で増えないものが２回で増えるか」ということを議論したいと考えているのです。
よろしくお願いします。

回答No.1

shimuraushiro

nest PCRのことでしょうか？

補足

同じプライマーを使うのでnested PCRではありません。