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アガロースゲル電気泳動でサンプルがウェルにスタック

PCR産物(2.5kb)の確認のためにアガロースゲル電気泳動を行っています。しかし、サンプルがウェルにスタックしてしまって、うまく流れてきません。マーカーはきれいに流れています。マグネシウム濃度を振ってPCRをしたのですが、マグネシウム濃度が高いサンプルほどウェルの付近ははっきりと光っているので、実はPCRはうまくいっているのではないかと考えています。どうやったらきれいに流すことができるのか教えてください。また、PCR産物をPCR-purification kitなどで精製して流すと改善されたりするのでしょうか?

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回答No.5

おそらくPCRのかけすぎ(テンプレート量やサイクル数が過剰)。 PCR産物がある程度増えた状態で、さらにサイクルを続けると、産物同士のミスアニールから伸長してどんどん長い産物ができます。ひどいときはお書きになったようにウェルにスタックするほど巨大化します。 Mgが多い方が増幅しやすい(反面ノンスペもでやすい)ので、Mg濃度の高い方がはっきり見えたんでしょう。

mila2009
質問者

お礼

テンプレート量は20ngだったのですが、サイクル数が36サイクルで過剰だったかもしれません。サイクル数を減らして再度トライしてみます。 Mgが多い方がノンスペもでやすいのですね。気をつけてみてみます。 どうもありがとうございました。

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その他の回答 (4)

  • otx
  • ベストアンサー率44% (256/576)
回答No.4

ゲルの% 泳動に使っているバッファー PCR反応に使っているバッファー 泳動時にアプライしたPCR産物の溶液はどうなっているのか (PCR反応後、その反応液の一部をそのまま流したとか) を書いた方がいいと思います。 ちなみに私は ゲル1~2%(分子量に応じて、2.5kbpだったら1%) 1×TAEや1×TBE PCR反応はTAKARAやTOYOBOとかいろいろ 反応液をそのまま10μlほどにローディングバッファーいれて泳動 です。 まず、質問者様のようになったことはありません。

mila2009
質問者

お礼

泳動条件は1%で、1xTBE、PCR反応液8μLにローディングバッファーを2μL入れています。やはりPCRがうまくいってないようですね。 ご丁寧にありがとうございます。

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  • owata-www
  • ベストアンサー率33% (645/1954)
回答No.3

まず、マーカーというのは分子量マーカーのことを言っているのか色素マーカーのことを言っているのかどちらですか? あと、UVとかで濃度は測りましたか? まあ、高塩か何かで粘度が高かったりすると流れないこともありますね。他には、DNA濃度が高すぎるとか あとはまさかですが、目的物よりはるかに大きいPCR産物が生成しているとかでしょうか

mila2009
質問者

お礼

マーカーは分子量マーカーです。 UVで濃度は測ってませんが、白い沈殿物のようなものがPCR後に生成していたので、おそらく目的物よりはるかに大きい産物ができている可能性がありそうです。どうもありがとうございます。

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  • dolphino
  • ベストアンサー率46% (56/121)
回答No.2

サンプルとマーカーを混合して流してみたら如何でしょうか。 そうすればマグネシウムが原因か分かると思います。

mila2009
質問者

お礼

質問の仕方が悪くてすいません。マグネシウムが原因と考えているわけではなく、マグネシウム濃度に依存してtotal DNAの量が変化しているように見えるので、何らかのDNAの量はPCRによって増えていそうだと考えただけです。でも素早い返答ありがとうございました。

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  • otx
  • ベストアンサー率44% (256/576)
回答No.1

あくまで質問者様が、マグネシウムが原因と思いなら(私にはそれが原因であったとしても理由はわかりませんが)、 エタノール沈澱してバッファーを交換してみてはいかがでしょうか? ついでにフェノクロもやっちゃったらどうでしょうか。

mila2009
質問者

補足

質問の仕方が悪くてすいません。マグネシウムが原因と考えているわけではなく、マグネシウム濃度に依存してtotal DNAの量が変化しているように見えるので、何らかのDNAの量はPCRによって増えていそうだと考えただけです。PCR産物をPurification kit で精製して泳動してみたのですが、結果は同じでした。ウェル付近でスメア状になっていてバンドは見えません。やはりこれはPCRを失敗しているのでしょうか?

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