- ベストアンサー
アガロースゲル電気泳動でサンプルがウェルにスタック
- みんなの回答 (5)
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
おそらくPCRのかけすぎ(テンプレート量やサイクル数が過剰)。 PCR産物がある程度増えた状態で、さらにサイクルを続けると、産物同士のミスアニールから伸長してどんどん長い産物ができます。ひどいときはお書きになったようにウェルにスタックするほど巨大化します。 Mgが多い方が増幅しやすい(反面ノンスペもでやすい)ので、Mg濃度の高い方がはっきり見えたんでしょう。
その他の回答 (4)
- otx
- ベストアンサー率44% (256/576)
ゲルの% 泳動に使っているバッファー PCR反応に使っているバッファー 泳動時にアプライしたPCR産物の溶液はどうなっているのか (PCR反応後、その反応液の一部をそのまま流したとか) を書いた方がいいと思います。 ちなみに私は ゲル1~2%(分子量に応じて、2.5kbpだったら1%) 1×TAEや1×TBE PCR反応はTAKARAやTOYOBOとかいろいろ 反応液をそのまま10μlほどにローディングバッファーいれて泳動 です。 まず、質問者様のようになったことはありません。
お礼
泳動条件は1%で、1xTBE、PCR反応液8μLにローディングバッファーを2μL入れています。やはりPCRがうまくいってないようですね。 ご丁寧にありがとうございます。
- owata-www
- ベストアンサー率33% (645/1954)
まず、マーカーというのは分子量マーカーのことを言っているのか色素マーカーのことを言っているのかどちらですか? あと、UVとかで濃度は測りましたか? まあ、高塩か何かで粘度が高かったりすると流れないこともありますね。他には、DNA濃度が高すぎるとか あとはまさかですが、目的物よりはるかに大きいPCR産物が生成しているとかでしょうか
お礼
マーカーは分子量マーカーです。 UVで濃度は測ってませんが、白い沈殿物のようなものがPCR後に生成していたので、おそらく目的物よりはるかに大きい産物ができている可能性がありそうです。どうもありがとうございます。
- dolphino
- ベストアンサー率46% (56/121)
サンプルとマーカーを混合して流してみたら如何でしょうか。 そうすればマグネシウムが原因か分かると思います。
お礼
質問の仕方が悪くてすいません。マグネシウムが原因と考えているわけではなく、マグネシウム濃度に依存してtotal DNAの量が変化しているように見えるので、何らかのDNAの量はPCRによって増えていそうだと考えただけです。でも素早い返答ありがとうございました。
- otx
- ベストアンサー率44% (256/576)
あくまで質問者様が、マグネシウムが原因と思いなら(私にはそれが原因であったとしても理由はわかりませんが)、 エタノール沈澱してバッファーを交換してみてはいかがでしょうか? ついでにフェノクロもやっちゃったらどうでしょうか。
補足
質問の仕方が悪くてすいません。マグネシウムが原因と考えているわけではなく、マグネシウム濃度に依存してtotal DNAの量が変化しているように見えるので、何らかのDNAの量はPCRによって増えていそうだと考えただけです。PCR産物をPurification kit で精製して泳動してみたのですが、結果は同じでした。ウェル付近でスメア状になっていてバンドは見えません。やはりこれはPCRを失敗しているのでしょうか?
関連するQ&A
- アガロースゲル電気泳動の失敗
作った1枚のアガロースゲルを使うレーン分だけ切り分けPCR産物を泳動したのですが、なにもでませんでした。先に使用したサンプルはマーカーもバンドも確認できました。 同じゲルで同じマーカーを使用したのに、なぜこんな事になったのでしょう??どなたか教えて頂けないでしょうか?宜しくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- アガロースゲル電気泳動時にサンプルやマーカーが浮いてしまいます。。。
アガロースゲル電気泳動を行ってDNAやPCR産物のバンドを検出する際に、アプライしたサンプルやマーカーが泳動中にゲルから浮き出てしまい、解析できないことがしばしばあります。 dyeはBPBを使用していて、100Vで30分ぐらい泳動していますが、10分ぐらいでゲルに青色のバンドが全く残っていないという現状です。 バッファーは1×TBE,ゲルも1×TBEで1~2%アガロースゲルを通常毎回作成して使用しています。 サンプルの精製度が悪ければ浮いてくるという話は聞いたことがありますが、マーカーも浮いてきてしまうので原因が全くわかりません。 ほかの人は同じマーカーを使用していてもこのような現象はないということです。 ゲルの作成方法に問題があるのかと考えましたが、全くわかりません。 考えられる原因をいろいろと教えていただければ、大変助かります。 どうぞよろしくお願い致します。
- 締切済み
- 化学
- アガロースゲル電気泳動
PCR法で処理したDNAをアガロースゲル電気泳動をしました。 レーン1 DNA分子量マーカー(1Kbp) レーン2~レーン4 PCR産物1 レーン5 DNA分子量マーカー(100bp) レーン6~レーン8 PCR産物2 レーン1からレーン4はアプライする時にゲルにさしてしまいました。 レーン5~レーン8はアプライは綺麗にはいりました。 結果はレーン1からレーン4まではバンドが見えたが、レーン5はライトにあてるとやっとなんとか見える程度で、レーン6~レーン8は何も見えなかった。 レーン6からレーン8はPCR産物2を入れ忘れたと考えられるが、レーン5の分子量マーカーがきちんとでなかった理由がわかりません。 どのような理由が考えられるでしょうか? またアプライするときにゲルにさしてしまったことで、さしてない方に影響出たりはするんでしょうか?
- 締切済み
- 生物学
- アガロースゲル電気泳動
現在、実験でアガロースゲルを用いて電気泳動を行なっています。 しかし、ポジティブコントロールは毎回バンドがでるのですが、目的とするバンドの方は、帯状にPCR産物が流れた跡のようなものが出るのみで、バンドが出なくなってしまいました。 1ヶ月くらい前まではきちんとバンドが出ていたので、プライマーの設計ミスでもなさそうなのですが、何が原因なのか分からず困っています。 PCRをかける前のDNAは10ng/μLで、実際電気泳動で流しているDNA濃度は測定していないため、分かりません。 ちなみに電気泳動の条件は以下のとおりです。 ・ゲル:1.5%アガロースゲル ・電圧:100V どなたか知恵を貸してください。 実際の電気泳動後の写真は、 http://oshietegoopcrdenkieidou.rakurakuhp.net/ に載せました。 よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- PCR後のアガロースゲル泳動について
PCRで増幅後、確認のためプラスミド精製、エタノール沈殿をしてから、TEに溶解後のサンプルを10μl泳動しました。 泳動後の結果を見てみると、とても発光が薄いバンドが見られました。(バンドが出た位置は大丈夫でした)いつもははっきり見えていたのにと思い、もう一度やってみましたが、結果は同じでした。私の研究室ではEtBrを先に入れてゲルを作っています。なにがいけないのかがわかりません。一緒に入れたDNAマーカーも薄いです。この発光の濃淡はDNA濃度とも関係してくるのでしょうか?わかりにくい質問ですみません。よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 電気泳動でウェルに白い沈殿が
アルカリ法で精製したDNAを泳動したのですが、まずウェルの部分に白い線が残り、次にウェルのすぐ下にバンドがひとつ、さらに下に濃度のマーカーと同じ位置にバンドがもうひとつ、と3つに分かれてしまいます。 目的のバンドはマーカーと同じ位置の、一番下のバンドだと思うのですが、ではその上のバンドとウェルの沈殿は何なのでしょうか。 DNA量が多いのかとも思い、1μlでも流してみたのですが、やはりウェルに白く残るものがあります。 ちなみにEcoで切ってもみたのですが、やはりウェルに白く残っていました。 これはDNAではないのでしょうか?何なのでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- アガロースゲル電気泳動におけるPCR産物バンドの乱れ
600 bpくらいのDNA配列をPCRで増やし、その産物をPEG沈して精製しているのですが、PCR直後の電気泳動(1.5% TBE gel)では1本のバンドなのですが、PEG沈後の電気泳動では2本になっています。 分子量で見ると、産物のバンド(600 bp)に加えて、450bp程度のバンドが新たに出現します。精製中に分解したのでしょうか?(でも、DNaseのコンタミだったらもっとズタズタに切れますよね)。それとも、精製過程で産物の一部が何か高次構造のようなものをとって、電気泳動上で二本になって見えるのでしょうか? 原因についてご存知の方、あるいは同じ経験をされた方、教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
- カラムの再利用(PCR産物精製)
PCR産物をアガロースゲル電気泳動したものを切り出しして、精製するのにPromegaのKitを使用しているのですが、 このカラムを再利用したいと思っています。 再利用できると聞いたのですが具体的な方法がわかりません。 よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- アガロースゲルからのDNAの単離
電気泳動を行ったアガロースゲルからDNAをBIO‐RAD社のPrep-A-Gene Purification Systemsによって単離しているのですが、このキットでは50kbまでのDNAしか単離できません。50kb以上のDNAをゲルから単離する方法にはどんな方法があるのですか?
- 締切済み
- 生物学
- 電気泳動写真からの濃度の求め方
DNA断片を1%アガロースゲルで泳動しました。EtBr染色し泳動写真からMarkerとの比較でDNA断片の大まかな濃度が求める方法を教えてください。Marker2を2マイクロリトッル使用。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
テンプレート量は20ngだったのですが、サイクル数が36サイクルで過剰だったかもしれません。サイクル数を減らして再度トライしてみます。 Mgが多い方がノンスペもでやすいのですね。気をつけてみてみます。 どうもありがとうございました。