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PCR産物のゲル抽出・制限酵素処理後の電気泳動

大腸菌のゲノムからPCRで目的遺伝子を増幅し、アガロースゲル電気泳動にて目的位置にバンドが出ていることを確認した後、目的バンドを切り出してゲル抽出をしました。 その後、2種類の制限酵素で1晩処理し、アガロースゲル電気泳動にて泳動しましたところ、目的位置よりも高い(重い)位置にバンドが出ました。((1))PCR後にはなかったバンドで、PCR産物の泳動後のバンドより高い位置にあったため、酵素処理の切れ残り・切断のされすぎなどは考えられないかと思っています。 仕方がないので、非目的バンドを避け、目的のバンドを切り出してゲル抽出・エタノール沈殿を行った後、アガロースゲル電気泳動にて泳動したところ、やはり非目的バンドが(1)と同じ位置に出ました。 また、別の遺伝子を別プライマーを用いて、同じような作業でPCR・ゲル抽出・制限酵素処理(上記とは別の2種類)を行ったところ、やはり同じように高い位置にバンドが出てきてしまいます。 PCRに使用する鋳型のゲノムは同じ物を用いているので、ゲノムがおかしいのでしょうか? そうだとしたら、PCR後に変なバンドが出ると思うのですが、PCR後には目的のバンドしか見えません。 このような場合、どのような作業が必要でしょうか? 同じような経験がある方、是非教えてください。 追記:非目的バンドは、ちょうど目的バンド×2くらいの重さの位置に出てきています。 なんらかの形で2つがセルフライゲーションしてしまうことなどはあるのでしょうか?

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みんなの回答

  • 回答No.4
noname#250373
noname#250373

状況を伺う限り、切り出しの過程に問題があるように思います。 切り出そうとしているPCR productのサイズと、切り出し操作、得られたDNAの溶解までの操作の詳細を記載してみてください。

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  • 回答No.3
  • negigi
  • ベストアンサー率60% (86/142)

水とか試薬のコンタミは確認しました? とりあえず、PCR→ゲル抽後にもう1回泳動してみるとか。

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  • 回答No.2

念のためフェノクロ処理をやってみたらどうですか。

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  • 回答No.1
  • otx
  • ベストアンサー率44% (256/576)

つまり、PCR直後に産物を泳動すると、バンドは1本・・・Aとします それをゲル切り出しして制限酵素処理した後泳動すると、バンドは2本 ということでいいでしょうか。 そして、その2本のバンドのうち、分子量が小さい方がAと同じである ということでいいでしょうか? もしそれで合っているのならば、1つ確認です。 Aと2本のバンドを同じゲルで並べて泳動して確認されたのでしょうか? Aと、2本のうちの分子量の小さなバンドが同じであるのでしょうか? というのも、 実は2本のうち、分子量の大きいバンドがAと同じであって、 分子量の小さなバンドは、分子量が大きいバンドが何らかの理由で 1本鎖になったものであるのではないかと思うからです。 そういうことをかつて経験しました。 DNAはある程度の大きさがあれば、 簡単には1本鎖にならないと思うかもしれませんが、 ゲル切り出ししたDNAを塩を含まない純水に溶かすと、 割と簡単に1本鎖になることがあります。 もしその可能性があるのであれば、確認してみてください。 参考までに。

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質問者からの補足

PCR後、制限酵素処理後、どちらとも1kbLadderをともに流しているので、Aともう1本の小さな分子量のものが一緒のバンドであると思っています。 また、PCR後と制限酵素処理後のものを並べて流したこともありますが、どちらともAと同じ位置にバンドがありましたが、制限酵素処理後はAとは別に分子量が大きいバンドが出ていました。

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