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pcr,アガロースゲル電気泳動について
学校でＰＣＲからアガロースゲル電気泳動の実験をしたのですが、考察で分からないことがありこまっています。 どなたか答えていただけませんか？ １．電気泳動を行い正しくアニーリングできたかを確認するためにはどうすればいいですか？ ２．ＰＣＲでＤＮＡのすべての塩基配列がわかっていればＰＣＲプライマーが目的位置に正しくアニーリングする確率も、間違った位置にアニーリングする確率も正しい位置にアニーリングする確率が間違った位置にアニーリングの何倍になるのかがわかると思うのですが、具体的になにをすればその確率がだせるのか？ 以上の２点なのですができたら早めに回答をいただけると嬉しいです。 よろしくお願いします。
- gajiroo
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- larme001
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「PCRの実験を行った」ということが漠然としすぎて少しわかりにくいです。PCRとはプライマーで挟み込んだ領域の少量の鋳型を温度変化のサイクルによって熱耐性菌由来のポリメラーゼを用いて増幅（基本的には対数的）に増幅させる技術です。その技術的な意味での実験を行ったのか、単にPCRで何かの断片を増やす学生実験か何かを行ったというのか、後者ならそもそも質問が余り的を得ていないようなきがしますが、、、。 1. アニーリングとはプライマーが鋳型に結合するステップのことを一般的には指しますが、そこが「上手く」行っているかどうかを示すのは単純ではないです。まあ断片がキチンと増えてくるのが見れれば少なくともアニーリングが起きていないと無理とは言えるでしょう。もちろん非特異的なのが増えたりする場合もあるのですが、それがうまくいっていないというのかどうか、という意味でしょうか？ 2.そもそも「何倍かわかる」という根拠は何でしょうか？ PCRはどちらかというと実際は経験則的な使われ方をするので、必ずしもTmがこうだから反応が何℃で何パーセント起こるというのはないです（むろんテクニカル的な解析をする研究とかはあるでしょうが、そういう意味ならわかりません）。ある化合物とある化合物の親和性が、水酸基が一つ付くからどれだけ定量的に上昇したか？というような問いに近いです。さらに、周囲の不純物やプライマーの濃度、プライマー同士の親和性鋳型DNAの純度、増幅断片の長さとかといういうものをある程度理論的にあくまで「経験的」に決まるものです。さらに言えば、3'側がある程度一致していれば5'側が浮いていても走ることも可能なわけで、そういういみでも完全一致の度合いが必ずしも定量的にアニーリングと相関するわけではないです。プライマー設計プログラムなんかでは、ある程度の一致度を何かしらのアルゴリズムで数値化しているでしょうから、そういう定量性は可能かもしれませんが、それが実際の挙動とくらべて正しいかわかりませんし、もしそういう意味での議論ができれば、それこそそういう分野の論文になるでしょう。 たぶん学生実験とかなら、余り複雑に考える必要はないと思います。
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質問者からのお礼
すいません。 説明不足」でしたね でもありがとうございました。