電気泳動してもバンドが流れません。

質問

PCRで増幅したものをアガロースゲルで電気泳動しても、ウェルの中から動きません。染色すると、ウェルの中で光っているのは見えるので、増幅はできているような気がします。
電気泳動の溶液が良くないのかと思い、E-gelでやってみたのですが、流れません。
DNAの状態がよくないのかと思い、同じDNAを用い、他のプライマーで増幅させたら増幅します。
プライマーがコンタミしているのかと思い、２社から新品で購入したのですが流れませんでした。

PCRにかけるときには、水とプライマーとDNAを入れています。水も毎回変えているので、正直原因がわかりません。
ちなみに、2回同じ条件で増幅できましたが、再現性がありません。

同じような経験もしくはアドバイス等ありましたら、お願いします。

回答No.3

de_tteiu

一つずつ可能性を消していった方がいいでしょう

昨年度全く同じ実験で増幅できていたと言っても、今回はできていないのですから、まずはPCRで増幅されているか確認してください　またアプライした量が適切かどうかも見てください

もしPCR産物が出来ていたとしたら、巨大なPCR産物が出来ている可能性が高いので、
アニーリング温度を変える（2stepの場合は3stepにする）
酵素を変える
プライマーを変える

などしてください

お礼

時間をかけて色々と試していきたいと思います。
アドバイスありがとうございます！

回答No.2

de_tteiu

なるほど、そうでしたらおそらくtemplate同士がアニーリングするなどして巨大なPCR産物が出来てしまい、泳動できなかったというケースでしょう

ところで
＞染色すると、ウェルの中で光っているのは見えるので、増幅はできているような気がします
吸光度を測るなどして増幅の確認はしなかったのですか？

補足

昨年度全く同じ実験で増幅できていたため、吸光度での測定による確認は行っていません。
巨大なPCR産物ができないようにするには、アニーリング温度を変えれば良いということでしょうか？

回答No.1

de_tteiu

質問の内容は
・目的のものと思われるPCR産物が泳動で確認できない
・そもそも泳動がうまくいかない

のどちらでしょうか？

補足

他の部位のプライマーを用いた場合、PCR産物は通常どおりに泳動できます。
また、ラダー（マーカー）は上手くながれているので、PCR産物のみが泳動できていない状況です。
かなり昔から実験されているもので、文献を参考にサーマルサイクラーも色々な条件でやっていますが、同じ現象が起きてしまいます。