三成分のライゲーションについて

質問

ＰＣＲで増幅した2種類のインサートを、直列に繋いでベクターに導入しようとしています。下のようになります。

EcoRI EcoRI HindIII　HindIII EcoRI EcoRI
----| |--------| 　|---------| 　|-----
ベクター　インサートＡ　インサートＢ　ベクター

この際、三成分を全て混ぜてライゲーションを行うと、ベクターが繰り返し配列を嫌うため？ホモダイマーは出来辛く、結果として目的のヘテロダイマーが優先的に出来ると説明を受けました。これはどういう事なのでしょうか？調べてみたのですが、相当する記述が見つからず疑問に思っています。ちなみにとりあえず三成分を混ぜてライゲーションしてみたのですが、一度目は失敗。現在2度目の形質転換中です。よろしくお願いします。

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

まずはリン酸化状態と失敗の状態はなんですか？
繰り返し配列はデリーションしやすい場合がありますが、
薬剤耐性部分が削れなければ、
コロニーは生えてきます

入れるベクターに制限酵素サイトが複数あるのでしたら、
ベクターの両側は別のサイトにした方が効率がいいです

お礼

MIYDさん、ありがとうございます！
リン酸化についてですが、実は全く脱リン酸化していません。セルフライゲーションが気になるんですが、「やらなくてもうまく行くはずだから、そのままやれ」という指示？を受けていまして…。まずはこのままやっています。ベクターの制限酵素サイトに関しても、あるプロトコール通りに再現して欲しいらしく自分の案は却下されたので、もうしばらく検討は出来ないです。効率悪いですが…。結果はライゲーション後の電気泳動では一部セルフライゲーションが起きているものの、おそらく目的の三成分が連結したものも見られています。それをDH5αに形質転換して、Cmでセレクションかけると全く生えない、というのが現在の状況です。コンピの活性は確認しているので、またサイズもトータルで8000kbなのでそんなに無茶ではないと思うんですが。薬剤耐性部分が削れる、というのが少し気になりますね…。調べてみます。
ところで「繰り返し配列はデリーションしやすい場合がある」というのは、どのような作用でそうなるのでしょうか？基本的な事なのですか？質問してばかりで申し訳ないのですが、なにかヒントがあれば教えてください。よろしくお願いします。

回答No.2

geneticist12

>この際、三成分を全て混ぜてライゲーションを行うと、ベクターが繰り返し配列を嫌うため？ホモダイマーは出来辛く、結果として目的のヘテロダイマーが優先的に出来ると説明を受けました。これはどういう事なのでしょうか？

E(insert A)H::H(insert B)E
がEcoRI cutのベクターに入ることを期待しているわけですが、可能性としては
E(insert A)H::H(insert A)E
E(insert B)H::H(insert B)E
というのもできてるわけです。しかしこれだと逆向き反復再列（広い範囲の回分構造）でできて不安定です。
一つにはこういった長い逆向き反復配列をもつプラスミドは致死的であること（おそらくちゃんと殖えないために薬剤耐性を発現できない。これがホモダイマーが出にくい理由の第一）、
もう一つにはプラスミド内で相同組換えが起こって欠失してしまうことによります（殖えなくなるほ高度な反復配列ではない場合。これを防ぐのにrecA hostが使われます）。

この実験の場合、ベクターを脱リン酸しないメリットは何もありません。

お礼

geneticist12さんありがとうございます！
ホモダイマーが出来にくい理由は納得できました！これで安心して実験できます。
実験の方は現在2回目の形質転換→失敗という感じです…。インサートＡのみ、またはＢのみだと簡単に導入できたのに、同時にやると全くコロニーが生えないので少し悩み中です。教授的には３成分を一気に組み立てるという方法を確立して欲しいらしいのですが、１つづつ導入した方が早い気がするので、そちらでもこっそりやってみようと思います。脱リン酸化も念のためやってみますね。
どうもありがとうございました！