※ ChatGPTを利用し、要約された質問です(原文:非環状プラスミドのライゲーションについて)
非環状プラスミドのライゲーションについて
このQ&Aのポイント
非環状プラスミドではタンパク質は作られない?大腸菌の目的遺伝子導入について
非環状のプラスミドで発現がうまくいった文献はある?学生の質問にお答えします
非環状プラスミドの形質転換は可能?大腸菌での異種発現について考える
よろしくお願いします。大腸菌での異種発現にとりくんでいる学生です。
大腸菌に目的遺伝子を形質転換する場合、
非環状プラスミドではタンパク質は作られないのでしょうか?
いま私がもってるのは目的遺伝子が導入された環状のプラスミドを
インバースPCRしたものです。
インバースPCRは目的遺伝子の一部を削る目的で行ったので、
アンピシリン耐性遺伝子や複製起点はそのまま残ってます。
非環状で、また両端はともに平滑末端です。
forward側はリン酸基がなく、reverse側はリン酸基があります。
PCR後の精製は済んでます。
教官から
"平滑末端の場合は大腸菌が環化のプロセスを行うから、
ライゲーションせずに形質転換していい"、
というよう助言をいただいたんですが、本当に大丈夫か心配です。
いろいろ探してみましたが、そういった記述のある文献はまだ見つけられません。
非環状のプラスミドで発現がうまくいった、またはそういう文献を読んだことのある方、
ぜひお話をお聞かせください。
補足
ご意見ありがとうございます。 セルフライゲーションは大腸菌が自発的に行うものではなくリガーゼの作用ですよね。 教官に制限酵素処理についても質問していたので処理を省いていいと指示があったのは ライゲーションではなく制限酵素処理のことだったかもしれません。 アドバイス通り、リガーゼを加えてライゲーションしてから形質転換します。