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プラスミドの精製

プラスミドpGLOで形質転換した大腸菌を増殖させ、アルカリ法を用いてプラスミドを精製させる実験を行いました。 大腸菌にグルコース、HCL、EDTAを加えた後、アルカリ処理を行いましたが、この処理時間が長いとどのような問題が発生するのでしょうか？ また、RNAを除去する前に、得られたDNAを精製水ではなく、HCLとEDTAに溶解させたのはなぜでしょうか？

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回答No.1

＞大腸菌にグルコース、HCL、EDTAを加えた後、アルカリ処理を行いましたが HCLは、Tris-HClバッファでしょう。HCl（塩酸）なんか入れたら、えらいことです。 ＞アルカリ処理を行いましたが、この処理時間が長いとどのような問題が発生するのでしょうか？ ↓ここをみてください。 http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=1383424 ＞精製水ではなく、HCLとEDTAに溶解させたのはなぜでしょうか？ DNAを溶解するとき、TE (10 mM Tris (pH8.0), 1 mM EDTA)と呼ばれる、薄いTris-HClバッファ＋EDTAがよく使われます。 バッファーは、DNA溶液を中性付近に保ちます。DNAの水溶液はやや酸性になり（核酸というくらいですから）、DNAに徐々にダメージをあたえるため、バッファーに溶解するのが良いのです。 EDTAを加えるのは、マグネシウムなどの二価の金属イオンをキレートして除くためです。精製といっても100％ということはありませんから、わずかでもDNA分解酵素が混入しているかもしれません。しかし、マグネシウムイオンがないとDNA分解酵素が効かなくなるので、分解を防ぐことができます。 また、DNA沈殿にマグネシウムイオンが結びついていると、非常に安定な沈殿となり、再溶解しにくくなります。EDTAを加えることによって、DNAを溶けやすくする意味もあります。

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