pGEX-6p-1の形質転換

質問

GEヘルスケアのベクターを使ったライゲーションとトランスフォーメーションがうまくいきません。以下に実験の概要を書きますので、どこに原因があるのか分かる方、アドバイスよろしくお願いいたします。

Total RNA抽出
↓
cDNA合成
↓
目的遺伝子の部分配列(1521bp)プライマーでPCR
↓
5'(Foward)末端にBamH1配列、3'(Reverse) 末端にStop Codon 配列を組み込んだプライマーで上記のPCR産物をテンプレとして再びPCR
↓
ゲル抽出
↓
ライゲーション(p-GEM-T-easy Vector Systems, Promega)とトランスフォーメーション（大腸菌はDH5α）
↓
コロニーPCR(M13プライマー)でインサートチェック
↓
プラスミド抽出
↓
シークエンス解析（全配列は読めなかったが、BamH1、Stop Codon配列は確認）
↓
制限酵素処理(BamH1、EcoR1)、同時にpGEX-6p-1ベクターも同じ制限酵素処理
↓
ゲル抽出
↓
ライゲーションとトランスフォーメーション（大腸菌はBL21、GEから購入し、自分で培養）
↓
コロニーPCR(pGEX sequencing Primer使用、ただし、経費節減のため、GEのものではなく、Operonに作ってもらった)
↓
なぜか、160bpくらいにバンドが出た

pGEXのライゲーションにはp-GEM-T-easy Vector Systems(Promega)を流用しています。
BL21には空ベクター(pGEX)が導入されることはコロニーPCRで確認しています。
後、制限酵素処理したベクターに脱リン酸化処理などもしてみましたが、結果は同じでした。
ですので、おそらくライゲーションがうまくいってないのでは、と思います。しかし、どうすればよいか分からないため、困っております。長文ですいませんがよろしくお願いいたします。

回答No.1

larme001 · ベストアンサー

BLにpGEXでライゲーションベクターを入れるなんという方法を取ってたらたぶん難しいと思いますけどね。　DH5aできちんとしたものをインサート全長よんでから、そのmini-prepの残りを10ulかそれぐらいをそのまま（原液でもいいです）トランスフォームして、数十個ぐらい生えれば良くできた方といった程度ですよ。ちなみにDh5aに同量で原液を形質転換したら全面がコロニーで埋まります。というか、入れ過ぎて逆に増えにくくなるくらいです。ちなみにpGEXはhigh copyなのですが、それでもその程度なので、BLってのはそもそもサブクローニングには向かない、それだけタンパク産生に特化した宿主だとおもってください。当然、ベクターを保存する場合も基本的にはDh5aで行いましょう。

そもそもこの場合、制限酵素サイトをつけて2回PCRをおこなう意味はあまりないです。増えないならともかく、TAクローニングするわけでもないならエラーが入る可能性があるのと手間が増えるだけマイナスなだけでしょう。あと、seq. primerなんてなんてぶっちゃけ読めればなんでもいいので、適当に注文して全長きちんと読みましょう。この場合は、コロニーPCRにも使えますし。

異なる制限酵素で入れる場合は脱リン酸化は不要ですし、問題ないにせよ多少導入効率が落ちる可能性さえあります。

補足

回答ありがとうございます。サブクローニングをBLでするのはそもそも向いてないということなのですね。全く知りませんでした。
ということは、DHにライゲーションしたpGEXベクターを入れたらいいのですね。そして、プラスミド抽出して、BLに入れたらいいのですね。是非、試してみます。

それと、2回のPCRするのは、BamH1サイトが、p-GEM-T-easyベクターにないからです。ウチにある制限酵素はあまり多くはないので・・・

脱リン酸化は不要なのですか？結構めんどくさいので、省けるには大いに歓迎です。
シークエンスですが、確かに全長が読めてないのは不安なので、きちんとやってみようと思います。因みに、pGEXのほうでもいいんですよね？

回答No.2

larme001

「5'(Foward)末端にBamH1配列、3'(Reverse) 末端にStop Codon 配列を組み込んだプライマーで上記のPCR産物をテンプレとして再びPCR」のプライマーの3'にEcoRIを入れて（もちろん足場を忘れずに）、cDNAから増やせば直接pGEXに入れれるとおもいますよ。かりにT vectorに入れるにしてもそのままいれて、pGEXに移すときにこれを使えば良くてわざわざはじめに2回PCRをする必要はないと思います。

シーケンスをどの段階でやってもいいですが、結局的に使うvectorは読む必要があるので、お金と時間とエラーの入る可能性でどこまでで確認したいかを天秤にかける必要があると思います。1.5k ぐらいならPCRでエラーが入る可能性は低いですから（ゼロではないですが）、だめだったら大抵cDNAからやり直すことになりますが、、、。　seq primerは、別になんでも読めればいいので、insertの6～800pbsぐらいのところに一つ、前、後ろに一つずつたぶんこの場合3つで読めば全長カバーすると思います。

dH5a→BLに関しては、PCRに比べてエラーは無視できるとみなしてシーケンスは不要です。ただし、幾つかコロニーを突っついて、小スケールで誘導かけた時の発現の良好なクローンを精製に使うことをお勧めします。

あと余談ですが、少しでも制限酵素を今後使うならBam, Xho, EcoRI, Hind, SaI, とベクターによってはNOTぐらいはあってもいいと思いますよ。NOT以外はそんな高くないですし、切れ安さや入りやすさも特に問題ない種類だと思いますよ。キャンペーンやってる時に買いそろえるとか。

お礼

またまたありがとうございます。就活でいなかったもので、返事が遅れてしまいました。PCRのことですが、いろいろなやり方があるのですね、この実験は隣の研究室の先輩に言われた通りにやってました。しかし、今回はエラーが少なそうなので、このままやってみようと思います。シークエンスはpGEXでもやってみたいと思いますが、外注なので手間がかかりますね。頑張ります。制限酵素に関しては、また同じような実験を後輩がするときに購入しようと思います。