プラスミドの制限酵素切断

質問

いつもお世話になっております。

TAクローニングからプラスミドを抽出し、制限酵素処理をおこなって発現ベクターへのインサートを調整する系の実験を行っております。

コロニーのダイレクトPCR,プラスミドのPCRいずれでも
目的のバンドは確認できますが、制限酵素処理を行うとうまく切断できません。（本来あるべきバンドよりかなり高分子のバンドが確認できます）

使用している酵素はXmnIとHindIIIです。

以前に他の制限酵素を用いていたときは問題なかったのですが。

ユニット数、処理時間をいろいろ試してもまったく
改善がみられません。

プライマーデザインの問題も考えられるのですが
他に原因が思い当たられるかたがいらっしゃいましたらご教示お願いいたします。

回答No.4

geneticist12 · ベストアンサー

3 kbのバンドがベクターであるという確信がおありなら、由来不明の2 kbのインサートが入っていると言うことで、いくら消化の条件を検討しても出ないものは出ないのでは。

また、これも可能性が高いと思うのですが、3 kbはlinear化したベクター、2 kbは切れ残ったCCCで、インサートが入ったクローンではなかったというストーリー。
その2 kbのバンドは、未消化の時には見えなかったものですか？

また、未消化のプラスミドは未消化の空のベクターより移動度が遅くなっていますか？
CCCのプラスミドサイズマーカーも売られているので、未消化のプラスミドでサイズの推定をすると良いのですが。

PCRはこわいです。クローニングがうまくいっていなくてもプレーティングセルに混ざっているライゲイション反応液や、環境中のコンタミからそれらしいものが増えてくることもあります。
PCRプライマーは目的の構造のプラスミドだけが増える、またはそれを区別できるようなデザインですか？

お礼

丁寧なご回答ありがとうございます。

PCRについてはTAクローニングの際にはプラスミドのプライマーとの組み合わせは行わず、常にインサートのプライマーを用いています。発現ベクターに組み込んだ際にだけ組み合わせたプライマーをデザインするのです・・

環境中のコンタミについてはネガティブコントがでていないことからまず否定できると思うのですが・・

他の皆様にご指摘いただいた件についてもう一度検討を行ってみます。

回答No.5

geneticist12

＞常にインサートのプライマーを用いています。

これ、一番危険なパターンです。
ligationされていなくても、大腸菌に入っていなくても、ligation反応に投入したインサート断片から増えてきます。
プレート上、コロニーでないところをついてもかなりの確率で出てきます。

インサートを挟むベクタープライマーか、ベクター・インサートの組み合わせのプライマーを勧めます。

回答No.3

MIYD

>2000bP付近と3000bP付近
インサートが入っていないものしか取れていなくて、
環状と1cutのベクターのような気もします。
制限酵素を片方ずつ処理した場合に、3.8kb(3kb+800bp)は見えるのでしょうか。

コロニーPCRかプラスミドのPCR産物をシーケンスしたときに、それぞれの制限酵素サイトは生きているのでしょうか。

補足

未消化（環状）のプラスミドを泳動したときのバンドとは3000bP付近のバンドは異なっているのです。

シークエンスと片方ずつの制限酵素処理についてはまだ行っていません。
TAクローニングなので甘くみていたのかもしれません。

回答No.2

geneticist12

＞コロニーのダイレクトPCR,プラスミドのPCRいずれでも
目的のバンドは確認できますが、制限酵素処理を行うとうまく切断できません。（本来あるべきバンドよりかなり高分子のバンドが確認できます）

うまく切断できていないのですか、全く切れてないのですか。未消化のプラスミドの泳動パターンと比較してどうなっていますか？

本来あるべきバンドというのは、ベクターのバンドも含めてどのくらいのサイズのバンドが予想されて、実際にはどう見えているのですか

お礼

未消化のプラスミドの泳動パターンと比較すると
切断がおこっていることは確認でき、2000bP付近と
3000bP付近（こちらが切断したベクターのバンド）に2本のバンドが確認できます。2回同様の作業を行ったところ、2回とも同じ様子でした。
また、あるべき（予想される）バンドは約800bPです。
2000bPより下には何もみえていません。

回答No.1

p0ntakun

もしかして、制限酵素や緩衝液を複数のメンバーで使っていない？
たまーに、こぼしちゃったりコンタミさせたりする人がいたりする。
特に学生の場合ね（笑）
怖くてなかなか言い出せないの。
この場合は、別ロットの試薬を使えば解決するよ。

あと、目的のDNA断片に変異が入ってしまったのかも。
ボクも絶対に切れない断片を見たことがある。
あの時はビビったなぁ・・・・

最後に、無いとは思うけど・・・・・・・
メチル化されてるとか!?
でも、まさかねぇ。
とりあえず、正常な菌株を外部から分けてもらう？

お礼

ありがとうございます。制限酵素・バッファーは個人管理ですので、自分の手技に関しては問題ありません。

メチル化はちょっと考えもしてみませんでした。

制限酵素の組み合わせを変えての発現も同時に行っていますのでそちらで発現してくれれば問題ないのですが・・