XhoI-SphI のライゲーション

質問

XhoIとSphIで1700bpのPCR産物をクローニングしようとしていますが、形質転換効率が非常に悪く、わずかに形質転換されたコロニーにもインサートは入っていません。
XhoIがPCR産物を分解しにくいという話はよく聞きますが、私は今まで別の遺伝子のクローニングに使って問題ありませんでした。今回のプライマーにも、上手くいっていた遺伝子をクローニングした時と同様、プライマーの制限酵素サイト外側に４塩基つけ、３７度二時間処理しました。
XhoIは、PCR産物の違いによって、同じ条件で処理しても切れたり切れなかったりするのでしょうか。

ライゲーションの方法自体に問題がないことはコントロールで確認した上で、ライゲーションの前後のDNAをアガロースゲルに流してみました。
ライゲーション前はベクターとインサートが問題なく見え、ライゲーション後は、バンドがいくつも見えました。いくつも見えたバンドの中には、

１．インサートのバンド
２．制限酵素処理したベクターのバンドよりやや小さいバンド
３．それからサイズのもっと大きいバンドが４本

でした。
一瞬、２．のバンドはきちんとライゲーションして環状になったものかと思ったのですが、このバンドは、使用したベクターよりはるかに明るいので、インサートが連なったものと考えるべきでしょうか。（因みに使ったインサートはベクターよりかなり多い）結局はこれを見ただけではライゲーションが上手くいっているのかわかりません。

XhoIを使われて同じような経験をされた方、どうぞアドバイスお願いします。

回答No.1

ga111

答えでありませんが：
PCR産物のクローニングにはTA cloning kitかそれに類するkitを使うことをお勧めします。

＞プライマーの制限酵素サイト外側に４塩基つけ
意図は理解できますが、なぜかうまくいかないことがあります。（なぜなんでしょうね？）４塩基でも短いのか？