ライゲーションについて…。

質問

またまたまたまた生物化学実験について質問です。
ベクターの構築方法についてです。
タンデムリピートベクターを作製しようとしているのですが、その過程で以下の行程があります。
一、ホス トベクターの断片とインサートの断片の片方のみをライゲーション。ライゲーション産物を泳動して精製
二、ライゲーション産物について制限酵素切断を行い、精製した後にライゲーション。ここで始めて環状となる。
以上の行程で目的ベクターの完成です。しかし、一、の精製時に目的のバンドが得られず、(5.4kbp辺りです)10kbp以上の部位にフニャフニャしたバンドが薄く出ていました。ここで質問なのですが、ライゲーション反応後にすぐに泳動したりすると、何か障害とかあるのでしょうか？エタ沈やフェノクロ抽出をせずに、そのままライゲーション液を電気泳動したので。
あと、うまくいかなかった理由として何かヒントのような助言をくださると助かります。ちなみに、使った試薬はニッポンジーンのT4DNAリガーゼです。

-詳細な説明-
最初にホストベクターをXbaIで切断します。ここにインサートDNAの片方の端をライゲーションで繋ぎます。インサートDNAの配列は
[NheI-(インサート)-XbaI-ApaI]となっております。XbaIの切り口NheIの切り口は相補配列です。ライゲーション後はXbaIでライゲーション産物を切断して再びライゲーションを行い、DNAの環化を起こそうとしたのですが、難しいでしょうか？

回答No.2

noname#250373 · ベストアンサー

解決できて何よりです^-^

質問とは全く関係ありませんが、
解決後も質問を終了しなかったり、
お礼率０％ではレスがつきにくくなりますよ^-^;

お礼

アドバイスありがとうございました！！

回答No.1

noname#250373

>ライゲーション反応後にすぐに泳動したりすると、何か障害とかあるのでしょうか？エタ沈やフェノクロ抽出をせずに、そのままライゲーション液を電気泳動したので。

まさにそこに問題があると思います。
私も、高分子にシフトさせた経験あります^-^;

対策ですが、FermentasのT4 DNA ligaseの取説の一部を引用すると

「Binding of T4 DNA Ligase to DNA may result in a band
shift in agarose gels. To avoid this, incubate samples
with 6X Loading Dye & SDS Solution (#R1151)
at 65°C for 10 min and chill on ice prior to loading.」

>DNAの環化を起こそうとしたのですが、難しいでしょうか？
操作が適切ならちゃんと作れると思いますよ^-^

おまけ：タンデムリピートでしたら、使用するE.coliの種類にも気を配った方が良いと思います。
知ってたらスルーして下さい。

参考URL：

http://www.fermentas.com/templates/files/tiny_mce/coa_pdf/coa_el0016.pdf

補足

SDSを加え、リガーゼを失活してから泳動してみたところ、5.4kbp辺りと、なぜか10kbpあたりにむちゃくちゃ薄くバンドが出てました。原因については考えてみます。ありがとうございます（＾∇＾）