ライゲーションがうまくいきません

質問

目的遺伝子をTAクローニングしたのですが、その後の発現ベクターへの
ライゲーションがどうしてもうまくいかず困っています。

インサートは約900bpで、ベクターはT7プロモーターのpET-9a(4341bp)です。
インサートとベクターを2種類の制限酵素(Nde1とBamH1)で5時間ほど処理し、
T4 ligaseを用いて14℃オーバーナイトでライゲーションしています。
ライゲーション後はBL21(DE3)pLysSを使用していますが、コロニーが全く発育しません。
DE3遺伝子保有株のため、IPTGも培地に添加しています。

制限酵素処理後、インサートも目的の長さのものが得られていますし、
電気泳動で確認する限り、切れ残りはないと思います。
制限酵素処理したベクターも未処理のものに比べ泳動されずらくなっているのが確認できるので
酵素処理で開環していることも確認できています。

インサートの開始コドンの読み取り枠もずれていませんし、
インサートもベクターも1μg超ぐらいの濃度でライゲーションを行ってるので、
量が少ないということも考えずらいです。(ベクター：インサート≒1mol：5molです。)

何か原因があるはずなのですが、思いつきません。
何でも教えて頂けると大変助かります。よろしくお願い致します。

回答No.1

larme001

詳細がよくわかりませんので、どこに問題があるかはポジコン、ネガコンを置いてそれぞれ確認する必要があるかもしれませんが、記載されている流れで気になった点は、

(1)インサートをTEクローニングで、、、という記載がよくわかりませんが、PCRベースで足場配列をプライマーにつけて増やす場合NdeIは最低でお6ベースくらい必要なため、3ベースくらいの足場しかつけていない場合かなり切れなくなります。

(2)そもそもNdeI自体は末端が2塩基しかないのでライゲーション効率が良くない酵素である。とはいってもべつに使えない程度ではないでしょうが、14℃ONでライゲーションってのは最適なプロトコルなのでしょうか？例えばtakaraのligation Mixとかtoyoboのligation highのようなキット化されたものであれば16℃で一時間もやれば十分と書いてありますけどね。

(3)インサートとプラスミドの量が多ければいいというわけでもないでしょう。多すぎると変にライゲーションされてしまうものも増えるのである程度の量で問題なければ別の要因かと思います。

(4)そもそもBL21にいきなりクローニングで使用するのはおかしいです。JMとかDH5aとかクローニング洋の安定的にプラスミドを維持できるものを使用すべきです。特にpETは低コピーですし、BL21に形質転換してもプラスミドを回収するのが難しい可能性だってありますよ。さらに付け加えると、IPTGをいれると蛋白合成にエネルギーが使われるので仮にうまくいってても余計に増えにくくなるような気もします。

＞制限酵素処理後、インサートも目的の長さのものが得られていますし、
電気泳動で確認する限り、切れ残りはないと思います。
制限酵素処理したベクターも未処理のものに比べ泳動されずらくなっているのが確認できるので
酵素処理で開環していることも確認できています。

これから判断するのは少し乱暴でしょう。可能なら(1)全く切ってないもの、(2)切ったものだけでライゲーションしたもの、(3)切ったものをライゲーションせずにそのまま、などのネガコン、ポジコンを並行して実験して(1)で生えてくるのに、(2)、(3)で生えてこないかごくわずかなのが確認できて初めて問題ないと判断できます。まあ、内部に既に組み込まれているものから内部を切り出して明らかに切れているバンドの位置を切り出しても少しは生えてきてしまうのでゼロにするのは難しいおともいますけどね。

とりあえず、BL21を使っている点と、末端の問題が一番影響として大きいのでそれをまず改善することでしょうね。

お礼

丁寧なご回答ありがとうございます。また、お返事が遅くなってすいません。
ちょっと説明が不十分でした。TAクローニングしたインサートは
一度INVαのコンピテントに導入後、選択剤入りの培地で菌を培養し、
そこから目的インサートの入ったプラスミドを抽出し、それを制限酵素処理しています。
pETベクターも同様にINVαに導入、培養後、プラスミドを抽出し、
インサートと同時に、同じ条件下で制限酵素処理をしています。
Nde1の足場配列は6なのですか？今は5しかありませんので、もしかしたら切れは悪いかもしれませんね…
参考にさせて頂きます。ありがとうございました。