- ベストアンサー
ライゲーション→トランスフォーメーション
ライゲーション→トランスフォーメーションが上手くいきません. トランスフォーメーション後のプレートにはコロニーは沢山生えてきます.ネガティブコントロールとしてベクターのみでライゲーション→トランスフォーメーションするとプレートには殆どコロニーは生えてきません. しかし,コロニーを拾ってMiniPrepし,適当な制限酵素で切断したりしてアガロース電気泳動すると予想だにしないバンドが出てきます.20個くらいに対し1個は予想されるところにバンドはくるのですがセルフです. ベクター(10 kbp)の方はBamH Iで制限酵素切断して,BAP処理をしています.インサート(2 kbp)はBgl II及びBamH Iで切断しています.Bgl IIとBamH Iの切断部位の相同性を利用したライゲーションです.濃度はベクターが0.03 pmolでインサートは0.3 pmolです. ライゲーション時間は1,3,17時間試しましたが,全てダメでした. 大腸菌はJM109です. ライゲーションが上手くいっていないのか,それとも大腸菌の中で異常が起きているのでしょうか?
- jikana
- お礼率41% (14/34)
- 生物学
- 回答数4
- ありがとう数7
- みんなの回答 (4)
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
#1です。 >インサートは,元々プラスミドの中にBgl II-insert-BamH Iで入っていたものを切り出して,ゲル抽出により精製しました.精製後のinsertはアガロース電気泳動で確認しました. >泳動バッファーは新しいものを使いました.染色液は使わず,エチブロをはじめに入れたゲルを使いました. 了解です。 だとすると、変な断片がやってくる余地はあまりなさそうですね。 切り出しを低波長の紫外線下で長時間かけて行ってしまって、変な断片になってしまったということもあり得なくはないでしょうが。 残る疑問点は、 >20個くらいに対し1個は予想されるところにバンドはくるのですがセルフです. というところですが、10kbと12kbなら、はっきり区別がつくはずですよね? だとすると、予想されるところにきたバンドがセルフというのはどういうことでしょう? あと、予想だにしないサイズというのは、具体的には? ベクターまたはインサートに、繰り返し配列等がないとすると、再編成がおこる可能性はあまりありませんね。 インサートは、大腸菌内で有害な作用をする可能性があるものでしょうか。だとすると、変なことが起こる可能性は大きくなりますが。 あと考えられるとすると、切り出しのときに、間違ってインサートじゃなくてベクターのバンドを切り出してしまってたりはしませんよね。 あとは、TEなどに、プラスミドが混入している可能性もありますが、同じものをネガコンにも同様に使っていたなら、その可能性はほぼ無視できますね。 とりあえず、最初からやり直してみることをお勧めします。 それでもうまくいかない場合は、低コピー数のベクターを使うとか、pUC系のベクターなら、培養温度を下げてコピー数を少なくしてみるといったことも有効かもしれません。
その他の回答 (3)
- Penfield
- ベストアンサー率36% (15/41)
もし、インサート用内部を認識するプライマーとベクターを認識するプライマーの両方をお持ちなら、ライゲーション後、に確認のためのPCRをしてみてはどうですか? あと、チェックの際も制限酵素の前にもしできるのならコロニーPCR(参考URLの2ページ目に方法の記載あり。)をすることをお薦めします。 もともとのプラスミドがコンタミしている可能性もあるので、切り出したインサートを制限酵素などでチェックすることもお薦めします。 ライゲーションの時間ですが、室温で2,30分で十分のような気がします。 特に長いからいいというものでもないと思います。 長すぎると、逆に問題が出てくる場合もあります。
- jellicle-cats
- ベストアンサー率42% (8/19)
ネガティブコントロールとして、ベクターのみだけでなく、インサートのみというのもやっていますか? もしインサートのみでコロニーが出てきてしまうようでしたら、インサート側にコンタミ(切り出しのときにインサート側のベクターが混ざっていた)がある可能性があります。 インサートが入っていたベクターの大きさがどのくらいなのか判りませんが、どうしてもコンタミしてしまうことはあります。インサートの切り出しのときに、ベクター側のみをカットするような制限酵素でカットしてから、BamHI/BglIIでカットするようにすれば、インサート側のベクターのコンタミは防げると思います。
お礼
質問してからの実験より,インサートの方が怪しそうな結果が出ましたので,確認のために試してみます.
- blackdragon
- ベストアンサー率35% (428/1222)
インサートは、どうやって調製したものですか? 電気泳動・切り出しはしましたか? 電気泳動したとすると、泳動バッファー、染色液は新しいものを使いましたか? ライゲーション前後のDNA溶液を一部とって電気泳動してみましたか?
補足
インサートは,元々プラスミドの中にBgl II-insert-BamH Iで入っていたものを切り出して,ゲル抽出により精製しました.精製後のinsertはアガロース電気泳動で確認しました. 泳動バッファーは新しいものを使いました.染色液は使わず,エチブロをはじめに入れたゲルを使いました. ライゲーション前後のサンプルは電気泳動して確認していません.確かに確認すべきところだと思います.
関連するQ&A
- ライゲーション、形質転換がうまくいきません
以前1629941で制限酵素処理について質問させていただいたものです。その後 約3kbpのpBluescript II sk (+)のmcsをEcoR1,Xho1で切断し、EcoR1,Xho1で切断した約1.6 kbp「プロモーター+ネオマイシン耐性遺伝子+polyA」断片を挿入したいのですが、全くコロニーができません。(LB培地+Ampにて)(ベクター、インサートともにゲル抜きしその後フェノール抽出した) ライゲーションの系はSDW:4.4マイクロリットル 10×T4buffer:1マイクロリットル 10mMdATP:1マイクロリットル インサート(190ナノグラム/マイクロリットル):1.6マイクロリットル ベクター(182ナノグラム/マイクロリットル):1マイクロリットル T4リガーゼ:1マイクロリットル もうひとつの系はインサート2マイクロリットル(SDWは4マイクロリットル) 16℃で14時間 そのライゲーション産物10マイクロリットルを100マイクロリットルのコンピテントセルに入れました。 pBluescript II sk (+)をコンピテントセルに入れる技術はあります。 制限酵素処理後、形質転換までに他にすべき操作があるのか? 根本的にどこか間違っているのか? やり直すとしたらどこからやり直すべきなのか? 教えてください。 今回使用した酵素、buffer全て新しく購入したものです。 よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- ライゲーションについて…。
またまたまたまた生物化学実験について質問です。 ベクターの構築方法についてです。 タンデムリピートベクターを作製しようとしているのですが、その過程で以下の行程があります。 一、ホス トベクターの断片とインサートの断片の片方のみをライゲーション。ライゲーション産物を泳動して精製 二、ライゲーション産物について制限酵素切断を行い、精製した後にライゲーション。ここで始めて環状となる。 以上の行程で目的ベクターの完成です。しかし、一、の精製時に目的のバンドが得られず、(5.4kbp辺りです)10kbp以上の部位にフニャフニャしたバンドが薄く出ていました。ここで質問なのですが、ライゲーション反応後にすぐに泳動したりすると、何か障害とかあるのでしょうか?エタ沈やフェノクロ抽出をせずに、そのままライゲーション液を電気泳動したので。 あと、うまくいかなかった理由として何かヒントのような助言をくださると助かります。ちなみに、使った試薬はニッポンジーンのT4DNAリガーゼです。 -詳細な説明- 最初にホストベクターをXbaIで切断します。ここにインサートDNAの片方の端をライゲーションで繋ぎます。インサートDNAの配列は [NheI-(インサート)-XbaI-ApaI]となっております。XbaIの切り口NheIの切り口は相補配列です。ライゲーション後はXbaIでライゲーション産物を切断して再びライゲーションを行い、DNAの環化を起こそうとしたのですが、難しいでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- アルカリホスファターゼ処理について
アルカリホスファターゼ処理について 制限酵素処理の後、アルカリホスファターゼ処理をおこなったのですが、 間違ってベクターだけでなくインサートも処理してしまいました。 ライゲーション反応を行った後、大腸菌に導入し、プレートにまいて培養したところ きちんとコロニーがはえていました。 この場合、きちんとライゲーションしていると考えてよいのでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- XhoI-SphI のライゲーション
XhoIとSphIで1700bpのPCR産物をクローニングしようとしていますが、形質転換効率が非常に悪く、わずかに形質転換されたコロニーにもインサートは入っていません。 XhoIがPCR産物を分解しにくいという話はよく聞きますが、私は今まで別の遺伝子のクローニングに使って問題ありませんでした。今回のプライマーにも、上手くいっていた遺伝子をクローニングした時と同様、プライマーの制限酵素サイト外側に4塩基つけ、37度二時間処理しました。 XhoIは、PCR産物の違いによって、同じ条件で処理しても切れたり切れなかったりするのでしょうか。 ライゲーションの方法自体に問題がないことはコントロールで確認した上で、ライゲーションの前後のDNAをアガロースゲルに流してみました。 ライゲーション前はベクターとインサートが問題なく見え、ライゲーション後は、バンドがいくつも見えました。いくつも見えたバンドの中には、 1.インサートのバンド 2.制限酵素処理したベクターのバンドよりやや小さいバンド 3.それからサイズのもっと大きいバンドが4本 でした。 一瞬、2.のバンドはきちんとライゲーションして環状になったものかと思ったのですが、このバンドは、使用したベクターよりはるかに明るいので、インサートが連なったものと考えるべきでしょうか。(因みに使ったインサートはベクターよりかなり多い)結局はこれを見ただけではライゲーションが上手くいっているのかわかりません。 XhoIを使われて同じような経験をされた方、どうぞアドバイスお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- ライゲーションがうまくいきません
目的遺伝子をTAクローニングしたのですが、その後の発現ベクターへの ライゲーションがどうしてもうまくいかず困っています。 インサートは約900bpで、ベクターはT7プロモーターのpET-9a(4341bp)です。 インサートとベクターを2種類の制限酵素(Nde1とBamH1)で5時間ほど処理し、 T4 ligaseを用いて14℃オーバーナイトでライゲーションしています。 ライゲーション後はBL21(DE3)pLysSを使用していますが、コロニーが全く発育しません。 DE3遺伝子保有株のため、IPTGも培地に添加しています。 制限酵素処理後、インサートも目的の長さのものが得られていますし、 電気泳動で確認する限り、切れ残りはないと思います。 制限酵素処理したベクターも未処理のものに比べ泳動されずらくなっているのが確認できるので 酵素処理で開環していることも確認できています。 インサートの開始コドンの読み取り枠もずれていませんし、 インサートもベクターも1μg超ぐらいの濃度でライゲーションを行ってるので、 量が少ないということも考えずらいです。(ベクター:インサート≒1mol:5molです。) 何か原因があるはずなのですが、思いつきません。 何でも教えて頂けると大変助かります。よろしくお願い致します。
- 締切済み
- 生物学
- ライゲーションが上手くいきません
ベクターの構築をしてるのですが、 インサートが5kbでなかなか上手く入ってくれません。 bluntと、5’突出末端でライゲーションしトラフォメ後、コロニーはでるのですが数も30こくらいで、多くはありません。 N,C(ベクターのみ)はコロニーがでていないのでセルフライゲーションは多くないのですが、目的のインサートを含んだコロニーがないんです。どうしたら良いでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- アダプターライゲーション?について
全長約6kbのベクターをEcoRI/XbaIで切断し、そこに大体55kbのアダプターをライゲーションしようと試みているのですが、なかなか成功しません。大腸菌のコロニーが生えてこないのです。ベクターのみのトランスフォーメーションでは、コロニーは生えてきませんでしたし、アダプター生成時のアニーリングがまずかったのか、他に原因があるのか分かりかねています。 ベクターはアルフォス処理はしておらず、インサート、つまりアダプターの方にはリン酸基が付加されていないので、理論上繋がることはつながるはずなのですが。 何か解決策が内ものでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- pGEX-6p-1の形質転換
GEヘルスケアのベクターを使ったライゲーションとトランスフォーメーションがうまくいきません。以下に実験の概要を書きますので、どこに原因があるのか分かる方、アドバイスよろしくお願いいたします。 Total RNA抽出 ↓ cDNA合成 ↓ 目的遺伝子の部分配列(1521bp)プライマーでPCR ↓ 5'(Foward)末端にBamH1配列、3'(Reverse) 末端にStop Codon 配列を組み込んだプライマーで上記のPCR産物をテンプレとして再びPCR ↓ ゲル抽出 ↓ ライゲーション(p-GEM-T-easy Vector Systems, Promega)とトランスフォーメーション(大腸菌はDH5α) ↓ コロニーPCR(M13プライマー)でインサートチェック ↓ プラスミド抽出 ↓ シークエンス解析(全配列は読めなかったが、BamH1、Stop Codon配列は確認) ↓ 制限酵素処理(BamH1、EcoR1)、同時にpGEX-6p-1ベクターも同じ制限酵素処理 ↓ ゲル抽出 ↓ ライゲーションとトランスフォーメーション(大腸菌はBL21、GEから購入し、自分で培養) ↓ コロニーPCR(pGEX sequencing Primer使用、ただし、経費節減のため、GEのものではなく、Operonに作ってもらった) ↓ なぜか、160bpくらいにバンドが出た pGEXのライゲーションにはp-GEM-T-easy Vector Systems(Promega)を流用しています。 BL21には空ベクター(pGEX)が導入されることはコロニーPCRで確認しています。 後、制限酵素処理したベクターに脱リン酸化処理などもしてみましたが、結果は同じでした。 ですので、おそらくライゲーションがうまくいってないのでは、と思います。しかし、どうすればよいか分からないため、困っております。長文ですいませんがよろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- ライゲーションがうまくいかない…(~_~;)
分子生物学の研究をしているものです。pcDNA3.1(+)というベクターをNheIとApaIで切断して、ここに自分の設計したインサートを導入しようとライゲーションを行っているのですが、なかなかうまくいかず、セルフライゲーションばかり起きてしまいます。ベクター、インサート共にゲルからの切り出し精製を行っているので、断片が混じっているようなことはないと思いますが…。ライゲーションがうまくいかない要因としてヒントを頂けると助かります。 ちなみに、ベクターとインサートのモル比を1:8,1:40,1:80,1:160でライゲーションを行いましたが、いずれもセルフライゲーションが起きていました…(~_~;)
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
大腸菌に対して有害な作用をする可能性のあるインサートとは?? blackdragonさんの言うように初めからやり直してみます.ありがとうございました.