プラスミドが取れません

質問

以前同じような質問があったと思いますが、ちょっと状況が違います。

私は今実験でInsert（約2.5kbp）をベクター（約3kbp）に挿入、形質転換、クローニングしています。青/白コロニー選択を用いて、白コロニーを選抜し、プラスミドをとりたいのですが、うまくいきません。

具体的には、プラスミドを取ったことを確認するため、制限酵素（λHind3）で処理し、電気泳動するのですが、全く何もバンドが見えません。青コロニーからはベクターそのものの長さである3kbpのバンドが見えます。

白コロニーから菌自体はとれています。アンピシリンを撒いているのに、プラスミドが全く入っていない白コロニーが出ているのでしょうか？

先輩が就活で質問できる人がいない状態で困っています。

回答No.1

noname#17364 · ベストアンサー

こんにちは。
　単純に考えて、アンピシリンの効きが弱くて、耐性プラスミドを持っていないヤツが白いコロニーとして生えちゃってるんじゃないですか？
　アンピシリンを新しくして、濃度を確認して培地を作り直してやり直してみては？

　ちなみにクローニングはTAですか？制限酵素サイトのライゲーションですか？いずれにせよ、2.5kbのインサートを入れるのは、比較的長いインサートなのでそれなりに難しいですから、ベクターとインサートの比率をちょっといじりながらいろいろ試す必要があると思いますよ。

回答No.3

maichigo

ベクターを変えてみることも一つの手だと思います。プラスミド抽出後の操作は何でしょうか？ただ、シークエンスを読みたいだけならば、どのベクターを使っても問題ないと思いますし、タンパク合成ならば、系によっては何種類かのベクターが用意されているはずです。
ライゲーションはうまくいっていますか？DNA ligaseは何を使用していますか？
TAクローニングならば問題は少ないと思いますが、ブラントエンド同士はもちろん、制限酵素により切断していても、くっつきにくいものはあります。T4 DNA ligase, ligation high等、各メーカーから様々な試薬が出ています。これらの情報はメーカーのカタログにたっぷり記載されています。制限酵素の情報は、NEBがとても役に立ちます！
自分の実験にあったものを使用すれば、きっとうまくいきます！がんばってくださいね！！！

回答No.2

noname#7004

先輩がいないと本当に困りますよね！
私も就活で、とかいう以前に先輩が存在しなかったので手探り状態でした。

コロニーをいくつ取って制限酵素処理したのでしょうか。
私の数少ない経験ですと、３０個中１つしか正常にプラスミドが入っていませんでした。
ひどい時には１００個に１つとか。

前提として、ライゲーションが上手くいっているのでしょうか。
2.5kbpと結構長いインサートなんで、なかなかくっつかないと思います。
ライゲーション処理後、ベクターと比較してバンドがシフトするか確認してください。