現在、インサートを組み込んでいるベクターの入れ替えを行っているのですが

質問

現在、インサートを組み込んでいるベクターの入れ替えを行っているのですが、
ライゲーション後、大腸菌のXLに形質転換し、コロニーが確認できました。
この時点で、コロニーが生えているにも関わらず、ベクターが入れ替わっていない、
またはプラスミドが環状になっていない等の失敗はあるのでしょうか。
このような失敗をご経験の方がいらっしゃいましたら、アドバイス願います。

ちなみに、制限酵素はBamHI, EcoRIを用いており、
ベクターはpBluescriptからpGEXに移そうとしています。

回答No.2

negigi · ベストアンサー

EcoRIとBamHIで完全消化されていればセルフの可能性はありません。問題となるのは、その一方が完全に切れていない場合です。そうなると、EcoRI同士またはBamHI同士でセルフする可能性があるので、注意が必要です。電気泳動ではリニアか2cutかの判断が難しいので、自分がうまくいかないときは、まずここを疑うようにしています。この2つの酵素は、まず切れないことはないと思いますが。2種の場合はエンドの形が同じでない限り、AP処理は不要です。

ご存知かもしれませんが、コロニーの段階で、インサートが入っているか確認する方法はあります。以下のリンクを参考にしてください。
http://cse.fra.affrc.go.jp/ksaitoh/InsertCheck.html

うまくいっているといいですね

お礼

丁寧なアドバイスありがとうございます。
大変勉強になりました！

回答No.1

negigi

結局、あなたは失敗したんですか？
質問の内容だけでは、失敗の原因は分かりません。
pGEXとpBluescriptは確か同じAmp耐性のはずですから、操作を誤れば入れ替わらない可能性はあります。また、当然ながら、セルフライゲーションでもコロニーは生えてきます。

とりあえず、確認しておきたいこととして、

1) 目的のプラスミドが得られていないことを、どのようにして確認しましたか？

2) Ligation反応前に制限酵素反応がうまくいったか、電気泳動などで確認しましたか？

3) 同じ研究室のメンバーにはなぜうまくいかないか聞きましたか？

以上、よろしくお願いします。

補足

ご指摘ありがとうございます。
大腸菌のXLに形質転換して、今はインサートチェックをしようとしているところ
なので、まだ失敗かは判明していません。
自分としては初めて行う実験のため、知識不足もあり、コロニーが生えてきた
段階でOKと思っていたのですが、そうではないことを聞いたので、早めに情報
を知りたかったのです。
まずは、質問に答えさせていただくと、

(1)まだこれは確認できていません。申し訳ありません。

(2)これは確認しました。

(3)当研究室は細胞系実験を主に行っているため、遺伝子工学に詳しい人がいません。
　また先生からも、「自分で勉強しながらやるように」と言われています。

また、補足として、二種の制限酵素(BamHI,EcoRI)を用いているため、セルフライゲーション
の可能性は考えていませんでした。二種の場合でも考えた方が良いのでしょうか。(念のために
アルカリフォスファターゼ処理をする等…)
ラーゲーション反応の時には、pBluescriptに組み込まれているインサートをPCRで増幅したものを
gel purification kitで精製して、インサートのみを取り出してきているので、pBluescript
はコンタミしていないものと考えて実験を行っていました。

でも、まずは、まだ失敗か判明していないので、最後のチェック等を行ってみます。