ガラスビーズへのプラスミドDNAの吸着について

質問

現在実験でFlexiPrepKit（アマシャム製）を用いて、8.1kbpのプラスミド（ベクター：7.2kbp、インサート：0.9kbp）を大腸菌から回収しているのですが、どうにも回収率が悪くて先に進めません。

そこで気になったのですが、プラスミドが大きいと回収率というのは落ちるものなのでしょうか。ガラスビーズに吸着する量も減少するのでしょうか。コピー数にも関係するとは思うのですが。

＊プラスミドは酵母大腸菌のシャトルベクター（YEｐFLAG-1）で、pUC系ほどコピー数は高くないと思います。
＊以前に自分で4kbp弱のTAベクター（インサート含み）を回収したことがあったのですが、そのときにはいっぱい取れたので技術には問題ないと思っています。
＊集菌は1.5mlから4.5mlまで試しましたが、回収率に有意な違いは得られませんでした。

やはり大量に培養して、低濃度のプラスミド溶液を回収し、エタ沈で高濃度にもっていくしかないのでしょうか。

よろしくお願いします。<(_ _)>

回答No.1

dora1

ご自分でもお書きのように、収量が少ない原因が特定できていませんね。グラスビーズの問題か、それ以外の精製過程の問題か、あるいはそもそもプラスミドが大腸菌に少ししか含まれていないのか。キットを使っていて、一番最後のプラスミドの収量だけで推測しようとしているからですね。どういう補足実験をすれば原因が特定できるのかはお分かりですよね？精製途中でのプラスミドの収率を計算してみないと...。なんとも申し上げられません。

さて、私が考えたことをご参考までいくつか書きます。
・一般にグラスパウダーによる精製では、DNAが短いと一旦グラスパウダーにくっついたのがはがしにくいので回収率が悪く、逆にDNAが長すぎるとグラスパウダーにくっつきにくいので回収率が悪い、というのは聞いたことがありますが、長いというのは8 kbpという程度ではなくもっとずっと長いときの話です。今回はあまり該当しないかもしれません。
・大量に培養することを渋っていらっしゃいますが、何か問題があるのでしょうか？4.5 ml培養のときの収量が、目的の回収量の何分の一なのかわかりませんが、50 mlとか、500 ml とかの培養を行うのには何か障害がありますか？（それとも何十リットルも培養しないといけない量しかとれていないのでしょうか？）
・インサートの配列によってプラスミドのコピー数が大きく影響を受ける場合がたまにあります。コントロールベクターの収率は如何でしょうか？
・YEpFLAGって、大腸菌で増殖するときのoriって、ｐBR322と同じColEではなかったでしょうか？それなら、ｐBR322系のプラスミドに使える「クロラムフェニコールの増殖ワザ」が有効なのではないでしょうか？YEpのマニュアルに書いてなければ、プロトコル集の類には大抵載っていると思いますので、その方法が使えそうか調べてみる価値があるかもしれません。

こんなところでお役に立てるかわかりませんが。