最近DNAの電気泳動がうまくいきません。どなたかアドバイスよろしくお願

質問

最近DNAの電気泳動がうまくいきません。どなたかアドバイスよろしくお願いいたします。

まず問題なのは、プラスミドの大きさが明らかに小さくでてしまうということです。
このプラスミドは大腸菌に組み込んでいて、タンパクの発現も確認できています。
インサートのみですが、シーケンスで確認もとれているのですが、ベクターのどこかが
欠けているのでしょうか。
また、欠けているとしてもその状態で菌のなかで安定に存在せきるものなのでしょうか。

回答No.2

ga111 · ベストアンサー

インサートとベクターが分かれるように切って、ベクターが小さいのなら、問題です。

ベクターがpGEXの場合、でインサートが毒である場合、プラスミドが排除され断片化されたように汚くなることがあります。この場合の対処は、発現するたびに新たにトランスフォームします。新たにトランスフォームせずに、菌体を冷凍、冷蔵するとよくないです。

補足

なるほど。
さっそく制限酵素で切ってみたいと思います。
しかし、新たにトランスフォームしなかった場合、どう悪いのでしょうか。
何かご存知なことがありましたら教えていただきたいです。
よろしくお願いいたします。

回答No.3

ga111

トランスフォームしない場合は、構築直後のおおもとのプラスミド溶液（あれば）からトランスフォームし直します。それがなければ、構築し直し。

わずかな断片化のような現象が起きているなら、トランスフォームはするでしょうが、発現が悪くなるでしょう。

お礼

ありがとうございます。
やり直してみます。

回答No.1

rakudasax

まずなんのplasmidを使用していますか？

タンパクの発現を制御するプロモータのリプレッサーが大腸菌にとって毒ということはないですかね？

私も以前、大腸菌でクローニングした際、プラスミドのどこかの部位がpop putしたことがありました。
あるリプレッサー持たないplasmidは、正常だったのに対し、持つものは、おかしくなっていたので、そのリプレッサーがいけないと結論づけたことがあります。

補足

回答ありがとうございます。
プラスミドの種類は
pGEX-6P
pCold
シリーズです。