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プラスミドの電気泳動
DNAがライゲーションされたプラスミドを大腸菌から抽出して電気泳動したのですが、酵素処理をしていないにも関わらず複数のバンドが表れました。特にプラスミドの大きさを超える大きなバンドが確認されましたが、これはなぜでしょうか？ プラスミドがダイマーを形成しているからとも聞きますが、プラスミドは結合方法も含めてどのように倍数化するのですか？ 又、プラスミドが何倍体になるかは決まっているのですか？ダイマーではなく、トリマーやテトラマーにはならないのでしょうか？ 教えてください。よろしくお願いします。
- sapiens-13
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普通にプラスミドとってくると、多少オープンサーキュラー（OC)になることがありますので、スーパーコイルしたままのものと2本のバンドが見えることはよくありますけど、それじゃないのですね？ あと、コンカテマーとよんでますが、プラスミドの2量体ができてしまうときもあります。ひどい（というかどうか知らないが）ときには、2量体どころか3量体、4量体・・とたくさんバンドが階段状に見えます。大昔、pTZを使っていた頃はコンカテマーすごかったです。ブルースクリプトに変えてからあまり見なくなりました。 2量体、3量体と書いてますが、繋がり方に二通りあります。二つのプラスミドが共有結合で、大きな1本のプラスミドになっているときと、鎖状につながっているときです。たぶん、鎖状です。というのは、ある配列をサブクローニングしたときのこと。あまりコンカテマーが出てひどいので、モノマーのところをゲルから回収し、それをそのまま大腸菌に入れて（つまり、ライゲーション操作してません）、プラスミドを回収したら、驚いたことに、もっとひどくなっていて、モノマーがほとんど見えなくなっていたことがあります。それで鎖状だろうと思っている次第です。 昔確かめた限りでは、コンカテマー2量体のアガロースでの電気泳動位置は（EtBrの入ってないゲルで）、モノマーのリラックス型（トポイソメラーゼをかけて作りました。OCと同じ位置に泳動されます（EtBr無しなら））とは少しずれてましたが、だいたい同じくらいの位置に来ました。早かったのか遅かったのかはもう覚えていません。プラスミドによって異なるだろうと思いますので、一般性は分かりませんが、OC近辺に出ていたら、OCそのものか2量体です。トポかけてみると上記のように区別がつくときもあります。
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- owata-www
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酵素処理をしていないためにスーパーコイルなどの高次構造によって移動度が違います あとは、ダイマーを形成している コンタミなども考えられますが
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お礼
回答ありがとうございます。とても参考になりました。