形質転換について

質問

PBSIIKS(-)（ベクター）にたいしてPCR法で増幅した16ｓｒRNA（の制限酵素XhoI処理済）ターゲット部分をライゲースさせる実験をおこなったんですが、組み換えベクターは核や染色体に影響を与えるのでしょうか？
自分は与えないと思うのですが、プレートで観察してみるとコロニー数が違いがあり、何らかの理由でコロニー数に影響があるとはおもわれるのですが。
教えてもらえるとありがたいです。

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

先にも形質転換効率について質問されているかたですね。
察するに、実習のレポートか何かでしょうか。ならばヒントだけ。

プラスミドベクターを制限酵素で切ったものに、同じ制限酵素で末端を切ったPCR産物を加えて、酵素（ligase)でつないだものを大腸菌に導入しているわけですね。
一分子のベクターに一分子のインサートが入ったものをとろうという目的ですが、酵素反応は、一種の化学反応なので、すべての分子が期待通りの反応をするわけではありません。どの末端がどの末端と結合するかはランダムで、必ずベクター一分子に対してインサート一分子結合させるとか、100%環状化させるというコントロールはできないのです。

インサート同士、ベクター同士、あるいは両者が交じり合って、直線状に重合し形質転換能がないものができるかもしれませんし（実はこれが最も多い）、切断されたベクターがインサートなしで再環状化（self-ligation, self-circularization)するかもしれません。当然、反応に加えたベクターのすべてが、形質転換能を持つ形で環状化するとは限らないので、無処理のベクターと比べれば、形質転換効率は下がります。

さて、このことを踏まえたうえで、

＞プレートで観察してみるとコロニー数が違いがあり、何らかの理由でコロニー数に影響がある

これは、インサートを持つコロニー（白色）と、インサートをもたないコロニー（青色）の出現数の違いを言っているのだと思いますが、その理由は単純に、ligation反応産物の中に、うまくインサートが入ったプラスミドと、インサートが入らず自己環状化したプラスミドが存在するからということです。その比率がどうなるかは、ベクターとインサートの比率とか、その他の工夫によっていろいろです。

補足

わかりやすい説明ありがとうございます。
青と白のコロニーが出る出ないの（blue-white selection)反応は原理もわかっているんですが、コロニーが何も処理をしていないベクターをインサートしたものに比べPCRで増幅したものをインサートした場合とではコロニー総数があからさまに違います。
↑インサートしたものの方がコロニー総数は少なかった。

質問の本題として、これはベクターに影響を受けているのでしょうか？
たとえ、ベクターが自己環化した場合であれ、ライゲースした場合であれ、それは青と白のコロニーが出る出ないの（blue-white selection)反応に関与するものであり、コロニー総数には関与してこない気がするのです。
自分の考えは間違ってますでしょうか？

回答No.3

geneticist12

あ、ひょっとして切断して直鎖状になったプラスミドも形質転換能があると誤解していませんか。

インサートのあるなしにかかわらず、環状化していないと形質転換能はないと考えていいです。切断したプラスミドはligaseによってうまいこと環状化しなければ（で、これが起こるのはそれほど頻度は高くない）役に立ちません。

お礼

ようやくわかりました！！
ありがとうございました☆

回答No.2

geneticist12

＞質問の本題として、これはベクターに影響を受けているのでしょうか？

いいえ、ですから関係ないです。

＞コロニー総数には関与してこない気がするのです。
＞自分の考えは間違ってますでしょうか？

無処理のプラスミドと、切断・ligationしたプラスミド、同量使って形質転換しても、同じだけコロニーが出るわけではなく、当然後者のほうが少なくなります。
先にも書いたように、いったん切ったプラスミドをligationしても100%が自己環状化、あるいはインサートが入った状態で再環状化するわけではないからです。うまいこと環状化できなかったプラスミド（実際はこちらのほうが多数派）は形質転換能はないので、その分、コロニーが少なくなるわけです。

わかります？