プライマーについて

質問

初めて生物分子実験をした初心者です。
先日、大腸菌を形質転換（ＧＦＰを導入したもの）からプラスミドを調整し、そのプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ＥＧＦＰ配列の増幅を行いました。用いたプライマーは、
forward 5'(GTGCTAGC)TGTGGAATTGTGAGCGGATA 3'
reverse 3' (TACTCGA)GTCACCGTCATCACCGAAAC 5'
です。
（）内の配列はＥＧＦＰにはなく、先生がプライマーに付け足したものです。その細工には理由があるとのことなのですが、（）内の配列がなくても増幅出来るのに、なぜ付けたのか分かりません。
どなたか分かる方がいたら教えて下さい。よろしくお願いします。

回答No.2

rnai · ベストアンサー

こんにちは。
自信がないのですが、PCR産物に、制限酵素サイトをつけたのかもしれません。
　そうすれば、これから入れようとするベクターにちょうど同じ制限酵素サイトに入れることができます。（もちろん、ベクターもPCR産物も同じ制限酵素サイトをもち、制限酵素で切っておいて、ライゲーションします）
ちなみに制限酵素NheIはGCTAGC、XhoIはCTCGAGを認識しますので、ちょうどプライマーにあります。
また、制限酵素サイトをプライマーにつけるためには、その認識部位に、2，3個の配列をつけると、より制限酵素に反応しやすいです。その２，３個の塩基はどういうものがいいのかは、それぞれの酵素で決まっており、それは業者が持ってくる本のところに載っています。

お礼

こんにちは。回答ありがとうございました☆★
親切でとてもよく分かりました。このような実験は初で、しかも専門じゃないので大変でしたが、本で読むより実際したほうが何倍も理解することが出来たのでよかったです。

回答No.3

yokochoco

もう回答は出ているのですが、気になったことがひとつありますので書かせていただきます。

先日、大腸菌を形質転換（ＧＦＰを導入したもの）からプラスミドを調整し、

とありますが、この文脈では「調製」が正しいです。
意外と間違う方が多いように思いますので。

お礼

あっ本当ですね（＞＿＜）今度から気をつけます。ありがとうございました！

回答No.1

myahmyah

増幅したPCR産物を次のステップで使用する場合、制限酵素サイトをつけておいた方が使いやすいことがあります。
そういうことではないかと思いました。
どんな制限酵素の認識配列かまでは記憶していませんが、付加した配列はなんらかの酵素が認識しそうな雰囲気はありますよね。
自信はありませんが。
それから、質問文にありますが通常プライマーなどの配列を書くときは５’側から書きますね。おそらく、質問文中にあるreverseの配列も5'からではないかと推測して回答しています。

お礼

reverseの配列5’からでしたf^^;間違えてました。ごめんなさい（＞＿＜）
回答ありがとうございました★☆