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ロングプライマーでのPCR

通常のPCRは20mer程度のプライマーで行います。しかし、現在実験の過程で70merのプライマーを使ってPCRをしようと考えています。これほど長いプライマーでPCRは可能でしょうか。また、可能ならPCRを行う段階での注意点を教えていただけないでしょうか。ちなみに、TM値を計算したところforward、reverse共にTM値が71でした。

みんなの回答

  • MIYD
  • ベストアンサー率44% (405/905)
回答No.3

変性と、アニール＆伸長反応の2段階で行うという意味です。

  • rimgojam
  • ベストアンサー率42% (3/7)
回答No.2

可能ですが、精製されたプライマーを使用することをおすすめします。(ゲル精製)70merで注文しても、ほとんどの分子がそこまで長くないです。 通常よりも特異性が高いので、伸び難いので、工夫してみる必要があると思いますが、tm値が71度と高いなら2stepPCRがいいと思います。ただ、TM値はあくまでも目安なので、実際にグラディエントをかけたほうがよいです。

  • MIYD
  • ベストアンサー率44% (405/905)
回答No.1

two step PCRで出来ると思います。 アニーリングと伸長反応を72℃で、 増やしたい長さと使う酵素に応じた時間をかけます。 増えない場合には、アニーリング温度を少し下げることもあります。 注意点は、プライマー合成時に十分に反応していないものがでてきて、 プライマーがデリーションしていたことがあります。

garunia
質問者

お礼

返答が遅くなって申し訳ありません。回答ではtwo step PCRでできるとのことでしたが、RT-PCRを行うということでしょうか。

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