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PCRとプライマーの融解温度

  • 質問No.5405257
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お礼率 14% (6/41)

今度の化学の実験でDNAの電気泳動実験をやります。課題で、調べてプライマーの融解温度を計算しなければならないのですが、いろいろ調べてみても計算の仕方がよくわかりません。

プライマーの配列は
Primer#1:5'-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-3'
Primer#1:5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3'

で、使う式は

Tm=81.5+16.6×logO.047+0.41×GC%-500/n

なんですが、このGC%とnと5'(3')の意味がよくわかりません。どうやって求めるのでしょうか?初心者でもわかるように教えていただけないでしょうか?

質問者が選んだベストアンサー

  • 回答No.3
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ベストアンサー率 40% (2105/5249)

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Tm(℃)=81.5+16.6*log[S]+0.41*(%GC)-(500/n)
の計算式が大元で、
[S]   :塩のモル数 
(%GC) :オリゴヌクレオチド中のGとC含量(%)
n    :オリゴヌクレオチドの長さ(pb)
となっています。塩濃度[S]は通常Na+イオンのモル濃度を差すがPCR反応液の場合次のルールで計算します。
1. K+イオンはそのまま加算する。
2. Trisイオンは0.65倍して加算する。
3. Mg2+イオンは計算に入れない。
たとえば、PCRバッファーの塩濃度が以下の場合には
50mM KCl
10mMTris-HCl (pH 8.4~9.0 at 25 ℃)
1.5mM MgCl2
なので、[S] = 0.05 + 0.67*.01 = 0.0567 (M)
よって、計算式は
Tm(℃)=60.8+0.41*(%GC)-(500/n)
となりますね。ご参考までに。
まあ参考URLに配列をいれると大体の値は出してくれるのですが。。。。
教育的にはどうかともいますけど。
お礼コメント
hotdog_ski

お礼率 14% (6/41)

ご親切にありがとうございました。大変勉強になりました
投稿日時:2009/11/02 00:13

その他の回答 (全2件)

  • 回答No.2

ベストアンサー率 44% (256/576)

忘れていました。
5’、3’ですが、

この図を参照してください。
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1d/AGCT_DNA_mini.png

この図で小さく5’、3’と書いてあると思います。このことです。
簡単に言うと、
DNAはヌクレオチドからできていますが、それが結合するのは
そのリン酸と糖のところです。

化学はよくわからないので下記のURLを参照してください。
http://mambo.kuhp.kyoto-u.ac.jp/~nonn/cpu/3.htm

Tm値を出すのには関係ありません。
お礼コメント
hotdog_ski

お礼率 14% (6/41)

勉強になりました!
投稿日時:2009/11/02 00:14
  • 回答No.1

ベストアンサー率 44% (256/576)

GC%というのは、そのものズバリ
プライマーの中のGとCの含まれる割合です。
GとCを数えてすべての塩基数で割ってパーセントを出すだけですよ。

nはプライマーの塩基数です。数えるだけです。
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