ALDH2遺伝子のPCR判定におけるプライマー設計の意図とは？
- ALDH2(アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ２)を持つ人(Normal)と持たない人(Mutant)を判定する実験を行っています。NormalとMutantは１塩基多型であり、PCRを行い、どちらのプライマーで増幅が起こるかによって遺伝子型を判定しています。
- ニッポンジーンのホームページ上のプロトコルによると、ALDH2遺伝子を増幅する際に用いるプライマーの塩基配列が示されています。しかし、Reverseプライマーが結合する部分の塩基配列において、NormalとMutantの間でミスマッチが生じています。
- 問い合わせた結果、ニッポンジーンではミスマッチ部の塩基「T」を「A」にしてPCRを行ったデータは持っていないとのことでした。そこで、プライマー設計にはどのような意図があるのか疑問が生じています。
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ALDH2遺伝子を増幅する際のプライマーは？
ALDH2(アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ２)を持つ人(Normal)と持たない人(Mutant)を判定する実験を行っています。 NormalとMutantは１塩基多型であり、Normal用プライマーとMutant用プライマーの両方でPCRを行い、どちらのプライマーで増幅が起こるかによって遺伝子型を判定しています。 この実験のプロトコルがニッポンジーンのホームページ上にあるのですが、用いるプライマー(Reverse)の塩基配列を調べたところ、 Forward : 5'-CAA ATT ACA GGG TCA ACT GCT-3' Reverse－Normal : 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT C-3' Reverse－Mutant : 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT T-3' となっています。 ところが、Reverseが結合する部分のDNAの塩基配列は Normal：3'-GGT GTG AGT GTC AAA AGＴ GAA G-5' Mutant：3'-GGT GTG AGT GTC AAA AGＴ GAA A-5' ↑ であり、↑部の塩基「T」はReverseとはミスマッチになっています。Reverseのこれに対応する部分は「A」になるべきではないでしょうか？ 不思議に思い、早速、ニッポンジーンに問い合わせたのですが、ニッポンジーンではT.Takeshita(1994)の論文を参考にしており、ミスマッチ部の「T」を「A」にしてＰＣＲを行ったデータは持っていないとのことでした。 このプライマー設計にはどのような意図があるのでしょうか？
- ikarijun
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質問者が選んだベストアンサー
参考URL、Methodsの第一段落に書かれていますが、 プライマーは5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT をつかっていて、 件の位置にmutationを入れることで、ALDH2が正常な人ではCTCTTCという制限酵素Ksp632Iの認識配列ができます。 増幅断片がKsp632Iで切れるか切れないかで判定していたようです。 ニッポンジーンのプロトコルはそれの名残ではないでしょうか。
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