• ベストアンサー
  • すぐに回答を!

primer設計

ヒトでは配列が分かっているがブタでは分かっていない遺伝子でPCRを行いたいです。 ヒトの配列からプライマーをPrimer3で設計しPCRを行ったのですが、欲しいバンドがでません。 変性は最初95℃5分サイクル内は1分、アニーリング温度は50℃から62℃まで3℃毎で1分、伸長は72℃1分(全て1kb以下なので)、最後に72℃10分です。 Forward6本、Reverse6本設計して組み合わせて試しました。 結果、どの組み合わせでも目的の大きさのバンドがでていませんでした。 何か工夫する点があれば教えていただけたらと思います。 時間の都合もあり、委託できたらとも考えているのですが、配列が類似していると言われている他種(ヒト)では分かっていても目的とする種(ブタ)で配列が分かっていない遺伝子では委託で作ってもらうことは出来ないでしょうか??

共感・応援の気持ちを伝えよう!

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
  • 回答No.1
  • otx
  • ベストアンサー率44% (256/576)

いくら条件をあげたところでprimerの配列がどのようになっているかわからないと何とも言いようがないです。 ちなみに、私は最低42℃でアニーリングさせたことがあります。 それでうまくいったことがありました。 なぜ50℃と下限を決めたのかわかりませんが、気持ちはわかります。 後、ある動物ではわかっていない遺伝子でも、他の複数の動物で明らかになっている遺伝子の場合、Degenerate primerを使いますが、 今やっているのって、それですよね?

共感・感謝の気持ちを伝えよう!

その他の回答 (1)

  • 回答No.2

遺伝子(アミノ酸)配列には多生物種に渡って保存されている領域とそうでない領域がありますが、貴プライマーは保存領域を元に設計されているのですか? ちなみに配列が分かって無いと委託合成は無理だと思います。 クローニングの委託なら可能かも知れませんが。

共感・感謝の気持ちを伝えよう!

関連するQ&A

  • ダイデオキシ法におけるプライマー配列について

    ダイデオキシ法におけるプライマー配列の設計は、フォアードプライマーは、目的の配列の3'→5'の前方に結合するように、リバースは相補鎖の5'→3'の向きで結合するように設計しますが、疑問があります。 (1)ダイデオキシ法は、普通のPCR(設計したプライマーで、はさまれた間が増幅される)と異なり、元のDNA鎖に何度もプライマーが結合し、その後にddNTPが結合して順番に塩基が読めるものと理解していて、出来上がった遺伝子断片に再び、プライマーが結合することはなく、もとのDNA鎖のみに何度も結合していくのですよね?この理解は正しいのでしょうか? (2)読めた配列のデーターに、プライマーの配列も読めるのでしょうか? プライマー以降にddNTPが結合していくので、プライマー自体は配列が読めない気がします。しかし、出来上がったプライマー+目的の配列を持ったDNA鎖に相補的にまたddNTPが結合すると、プライマーを含めた目的の配列が読める気がします。プライマーがなくてもddNTPは相補的な配列をもったDNA鎖に結合することができるのでしょうか?プライマーが結合し、そこからポリメラーゼが来て、dNTPを使って伸長反応をするので、プライマーがなくてもddNTPが結合して配列が読めるというのは間違っていますよね?設計したフォアードの配列がシークエンス結果の配列にあってなぜ読めるのか不思議になりました。 (3)伸長反応は酵素にもよりますが、全長は伸びず途中までしか読めないことから、シークエンス解析では、フォワードとリバースをプライマーに用意しますが、疑問があります。リバースを用いて読めた配列を反転し、フォワードを用いて読めた配列と結合するのは、機械が自動的にしてくれるのでしょうか? 頭がこんがらがってしまい、困っています。どなたかよろしくお願いします。

  • プライマー設計

    プライマー設計 PCRのプライマーの設計のポイントに 「部分的にGCあるいはATに片寄らず、特に非特異的な反応を避けるため、プライマーの3’側はGCリッチにならないようにする」 という文があるのですが、それは、 同じ塩基が続く箇所やタンデムリピートなどの繰り返し配列は特異性を損なうため避ける必要があるということと、GC リッチだとプライマー同士やプライマーの分子内で結合してしまいPCR反応が進まなくなることがあり、また遺伝子の構造上GCリッチな領域も存在するので、そちらに結合してしまうこともあるから。という解釈であっていますでしょうか? また、他の記述に 「プライマー3’末端をGCとすることで、その部分の二本鎖がアニーリングの温度を上げても維持されやすくなり、より特異的なPCR反応が期待できます」 というものもありました。 3'末端は結局GCリッチのほうがよいのでしょうか?GCリッチじゃないほうがよいのでしょうか? 基本的なこととは思いますが、ご回答よろしくお願い致します。

  • RT-PCRにおけるプライマー設計について

    はじめてお世話になります。 通常のPCR時におけるプライマー設計は理解できるのですが、RT-PCRにおいては、はじまりが1本鎖のcDNAであるということでひっかかりを感じます。 cDNAの塩基配列がわかっていますのでそれをもとに遺伝子解析系のソフトを用いてプライマーを設計したところ、sense-primerの配列が、cDNAの相補鎖となるものと相補的になっていました。(anti senseのほうはcDNAと相補的だったのですが) 実験書を読むとsenseがまずcDNAとアニールして2本鎖になってから通常のPCRがはじまるというふうに理解できましたので、上記のプライマー設計ではPCRがおこらないということでしょうか? この場合はcDNAの相補鎖に対してプライマー設計をおこなえばよいのでしょうか。 それともこのままのプライマーでよろしいのでしょうか? よろしくお願いいたします。

  • プライマー

    NESTEDまで行うPCRのプライマーを設計したのですが、実際行ってみると、NESTEDまでPCRを行ったものはくっきりとバンドが出でいたのですが、ファーストPCRを行っただけのPCR産物の方にはバンドがほんとにごくわずかしかでていません やり直した3回とも同じ結果です 以前ほかのものを行った時も、ほとんどバンドが出ないプライマーのセットがありました きちんと作成して、存在するはずの塩基配列のプライマーなのに、このようにPCRで増幅しにくいものがあるのはどうしてでしょうか

  • プライマーなしでのOverlap Extension PCRについて

    異なる遺伝子(PCR産物)を鋳型にしたPCRで、プライマーを付けずに伸長反応をさせることにより、異なる遺伝子をつなぎ合わせて、その後プライマーを入れてのPCR反応により、異なる遺伝子をつなげて増幅できると論文にありましたが、プラマーがないと異なる遺伝子が反応せずに残るのではないかという意見もありました。 このようなOverlap Extension PCR場合、サイクル数、プライマーの有無はどのようにすればよいのでしょか?

  • PCR法について

    増幅させたい遺伝子が変わると、PCR条件が異なり、たとえば熱変性は90~100℃で、アニーリングは60~65℃で、DNA鎖の伸長は70~75℃で行われる。これらの各操作での温度は、いったいどういう理由で定まっているのか、をおしえていただけないでしょうか? よろしくおねがいします

  • Primer3のLeftとRightの方向

    こんにちは。 Primer3でプライマーの設計をしています。 そこで、Primer3で表示されるLeft primer、Right primerは それぞれ知りたい配列をどちらの方向に伸ばすためのもの なのでしょうか? Leftが目的配列を5'→3'、Rightが3'→5'へ伸ばすと考えて、 Leftがフォワードプライマー、Rightがリバースプライマーと 考えても良いのでしょうか?

  • PCRのプライマーって

    ある遺伝子をゲノムからクローニングしてきてタンパク発現を行おうとしています。 しかし、PCRの段階でcDNAが増えません。 増えない理由として、プライマーの設計が間違っているからと指摘を受けました。遺伝子操作にはだいぶブランクがあるので、あまり自信がないのですが、 例えばgenebank などで検索したある遺伝子の配列が AGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTAG だとすると、 AGT側が5’TAG側が3’だという事で 5’側プライマー AGTGGGGG…→ 3’側プライマー CTACCCCC…→ と設計しました。 しかし、シーケンスの5'と3’を逆に捕らえていると指摘されたのですが…。 私の理解は間違ってたんでしょうか。 そんなことないと思うんですが・・。 ちょっと自信がなくなったので聞きに来ました。 よろしくお願いします。

  • プライマーについて

    初めて生物分子実験をした初心者です。 先日、大腸菌を形質転換(GFPを導入したもの)からプラスミドを調整し、そのプラスミドを鋳型としてPCRを行い、EGFP配列の増幅を行いました。用いたプライマーは、 forward 5'(GTGCTAGC)TGTGGAATTGTGAGCGGATA 3' reverse 3' (TACTCGA)GTCACCGTCATCACCGAAAC 5' です。 ()内の配列はEGFPにはなく、先生がプライマーに付け足したものです。その細工には理由があるとのことなのですが、()内の配列がなくても増幅出来るのに、なぜ付けたのか分かりません。 どなたか分かる方がいたら教えて下さい。よろしくお願いします。

  • ALDH2遺伝子を増幅する際のプライマーは?

    ALDH2(アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ2)を持つ人(Normal)と持たない人(Mutant)を判定する実験を行っています。 NormalとMutantは1塩基多型であり、Normal用プライマーとMutant用プライマーの両方でPCRを行い、どちらのプライマーで増幅が起こるかによって遺伝子型を判定しています。 この実験のプロトコルがニッポンジーンのホームページ上にあるのですが、用いるプライマー(Reverse)の塩基配列を調べたところ、 Forward : 5'-CAA ATT ACA GGG TCA ACT GCT-3' Reverse-Normal : 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT C-3' Reverse-Mutant : 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT T-3' となっています。 ところが、Reverseが結合する部分のDNAの塩基配列は Normal:3'-GGT GTG AGT GTC AAA AGT GAA G-5' Mutant:3'-GGT GTG AGT GTC AAA AGT GAA A-5'                         ↑ であり、↑部の塩基「T」はReverseとはミスマッチになっています。Reverseのこれに対応する部分は「A」になるべきではないでしょうか? 不思議に思い、早速、ニッポンジーンに問い合わせたのですが、ニッポンジーンではT.Takeshita(1994)の論文を参考にしており、ミスマッチ部の「T」を「A」にしてPCRを行ったデータは持っていないとのことでした。 このプライマー設計にはどのような意図があるのでしょうか?