現在、GST融合タンパクを精製しているのですが、樹脂に吸着させた後、T

質問

現在、GST融合タンパクを精製しているのですが、樹脂に吸着させた後、ThrombinでGSTを切り離してから溶出させています。
その際、SDS-PAGEで確認するとタグは切れているようなのですが、樹脂に絡まって溶出されてこないというトラブルに合っています。
このような問題の場合、一般にはどのような対処をされていますか。
私は、塩濃度を上げてみる、溶出bufferにTriton等を入れてみる、などを検討しているのですが…

回答No.1

wriwri · ベストアンサー

その融合タンパクで何をしたいのか解りませんので明確な答えにはなりませんが、まず１）お書きになっているようにＮａＣｌの濃度をおよそ１－１．５Ｍにして溶出することを試みます。２）もし、うまく行かなかったらＣｈａｏｔｒｏｐｉｃ試薬例えば尿素（６Ｍ）あるいはグアニジン（４Ｍ）で溶出します。しかしながら（２）の方法ですと３次元構造は壊れますので注意してください。収量は少なくともできるだけＮａｔｉｖｅなものが欲しければ（１）を採用します。（１）、（２）双方とも透析で塩を除きますが透析膜のＭＷＣＯ値に注意してください。また、溶出バッファーにＴｒｉｏｔｏｎをいれても大して効果はありませんし、後からＴｒｉｔｏｎを除くことはほぼ不可能に近いですのであまりお勧めはできません。ＳＤＳも同様です。

さらに樹脂にロードする融合タンパクの量が多すぎるとアグってしまい樹脂から出なくなりがちなので「たんぱく量と樹脂の比」も重要な検討課題だと思います。Ｔｈｒｏｍｂｉｎで切断する前にどのような条件で樹脂を洗っているか、そのバッファー組成の検討も大事です。

お礼

ありがとうございます。条件検討をもう一度確認してみます。

回答No.2

otx

GSTビーズがカラムにつめられたものをお使いでしょうか？（カラム法とか言ったりする方法でしょうか？）
それだとアグってしまうと（本当にアグっているとして）もうカラムの中には手出しが難しいので

単純に、GSTのビーズを15mlのチューブ内でGSTタンパク質と結合させたり、洗ったりして
（ビーズは遠心して集める）精製を行なえばいいのではないでしょうか。
（バッチ法とか言ったりする）

その後、タンパク質が結合しているはずのGSTビーズを15mlのチューブ内で
トロンビン溶液を作用させれば良いんじゃないでしょうか？

このとき、本当にタンパク質が切断によってアグってたとしても
チューブ内だったら見てると何らかの変化が観察できるかもしれませんし、
このとき、うまくやるとビーズを沈殿させるのと、アグったタンパク質の沈殿を
異なる遠心力で分けることができるかもしれませんし。

お礼

ありがとうございます。試してみます。