タンパク質の分離精製・カラムクロマトグラフィについて
- タンパク質の分離精製に用いられるカラムクロマトグラフィには、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどの異なる原理があります。
- イオン交換クロマトグラフィでは、タンパク質の電荷を利用して分離を行います。溶媒のpHや塩濃度を変えることで分離を調整することができます。
- ゲルろ過クロマトグラフィでは、タンパク質の分子サイズを利用した分離を行います。小さい分子はゲルの小孔に入り込むため、溶出が遅れます。
- ベストアンサー
タンパク質の分離精製・カラムクロマトグラフィ
大学院入試の過去問です。 『タンパク質を分離精製するカラムクロマトグラフィについて原理の異なるものを４つ説明し、それぞれ目的タンパク質の「分離精製が困難なケース」について述べよ。』 私のわかる範囲では (1)イオン交換クロマトグラフィ タンパク質の電荷で分離。溶媒のpHや塩濃度を変えて分離していく (2)ゲルろ過クロマトグラフィ 大きさで分離。小さい分子はゲルの小孔に入り込むため溶出が遅れる (3)アフィニティクロマトグラフィ 抗原抗体反応や基質特異性などの、タンパク質が特定の化合物と結合する性質を利用。 以上の３つしかわかりません。もうひとつは何なのでしょうか？ 「分離精製が困難なケース」については教科書３冊を用いて調べても載っていませんでした。 わかる方、どうかよろしくお願いします！！
- 345020
- お礼率76% (10/13)
- 生物学
- 回答数1
- ありがとう数3
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
下HPに四つありますね（吸着クロマトグラフィ－、分配クロマトグラフィ－、イオン交換クロマトグラフィ－、サイズ排除クロマトグラフィ－）。分配クロマトグラフィが四つ目です。 困難なケースはカラムの性質をそのままかけばいいのでは？ 吸着クロマトグラフィ－-同じ化合物と結合する蛋白は分離しにくい。 分配クロマトグラフィ－-極性が近い蛋白は分離しにくい。 イオン交換クロマトグラフィ－-電荷が近い蛋白は分離しにくい。 サイズ排除クロマトグラフィ－-サイズが近い蛋白は分離しにくい。ゲルろ過はこの一種。 とか。
関連するQ&A
- どうすれば、分離精製ができるか？
弱酸性化合物と弱塩基性化合物、非イオン性化合物を含む水溶液がある。抽出操作によってこれら三種を抽出・精製したい。どうすれば、分離精製できるか？有機溶媒にはシクロヘキサンを用い、水ーシクロヘキサン間の分配係数は、三種の化合物とも９とする。
- 締切済み
- 化学
- タンパク質の精製 アフィニティにくっつかないんですが・・・
はじめて質問します。学生です。 原株からあるNADPH依存のタンパク質を単離精製しているんですが、収量が少なく、より良い精製法を検討中です。 NADPH特異性のあるCibacron Blue F3GA色素を担体リガンドとした、いわゆるBlueカラムを試したのですが、目的酵素が結合せず、うまくいきません。（正確には少し結合しているようで単ピークで溶出するのですが、素通り画分の方が酵素活性が高い状態です。ベット量はカラムのタンパク質結合容量以下でやっています。） 至適ｐＨのリン酸バッファーで、KClでグラジエント溶出しています。 （カラムの説明書通りの条件です。ただし説明書ではアルブミンを精製しています。） 結合しない原因は何なのでしょうか？ 或いは陥りやすい操作ミスなど、少しでもわかる方は是非教えてください。 また、文献を探したところ、酵素溶液に基質を加えたり補酵素を加えたりすることで結合容量が増すようなことが書かれているものもあったのですが、その他に検討すべきことはあるでしょうか？ ご存知の方いましたら、ご教授願います。
- ベストアンサー
- 生物学
- たんぱく質の精製・構造解析について
現在抱えている課題の中で本当にどこから手をつけていいのやら悩んでしまったものが..... 【あるたんぱく質Aの生物的活性を保ったままに精製し、一時構造を解明する実験の手順を考えよ。 ただし3回の条件の異なるイオン交換クロマトグラフィを必ず行うこと。】 というものです。 タンパクの性質は大体要約すると 分子量約90,000、細胞質に分布 等電点7,5付近 SDS-PAGEで45,000 硫安濃度40～60％に分画 pH3以下で失活、6～8,5ぐらいで安定 pH8,2での陽イオン交換クロマトで0,1M NaClで溶出 pH6,5での陰イオン交換クロマトで0,05M NaClで溶出 たんぱくAはある酵素で、化合物Zにも結合できる、しかしZはほかの多数のタンパクにも結合してしまう。 Zに結合する他のタンパクは、イオン交換クロマトで除ける。 【使えるもの、機材】たんぱくAと特異的に反応する抗体１・２ 抗体1と結合した担体（A） Zと結合した担体（B） 各種実験に必要なものはすべてある 大体はこんなところです。タンパクAは実際にはないもののようです。 自分でも考えてみたのですが、とりあえずどこからはじめればいいのかまるで見当がつきません！！ だいたいの流れだけでもわかる方、ぜひ教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いします！！
- 締切済み
- 化学
- 分子間相互作用・タンパク質の精製法
こんばんは。 分子間相互作用とタンパク質の分離精製方法、一次構造決定法(実際に実験したことはありません)で質問があります。 (1)疎水性相互作用は溶媒が水の場合のみ形成されるのでしょうか？ 極性溶媒なら可能なのでしょうか?ヘキサンなどの有機溶媒は極性がないので形成されないのでしょうか? (2)分離精製されたタンパク質は未変性タンパク質なのでしょうか？ いろんなことをやっているうちに変性してしまうような気がするのですが・・・。 (3)硫安分画では溶解度を利用したものですが、それはタンパク質の分子量に関係しているのでしょうか。(タンパク質の分量が大きいほど低い硫安濃度で沈澱するのでしょうか？) (4)MS/MSは大きいタンパク質をそのま打ち込むことによって一次構造が決定できるという問題があったのですが、そのまま打ち込むということはどういうことなのでしょうか?ゲノム情報なしに～という意味なのでしょうか？ 長くなりましたがよろしくお願いします。
- 締切済み
- 化学
- タンパク質の精製の実験について教えてください
授業の実験でタンパク質の精製（血清アルブミンとチトクロームｃの分離） という題目の実験を行ったのですが、タンパク質資料（（チトクロームｃ、ウシ血清アルブミン、フェリシアン化カリウムを0.5Ｍ ＮａＣｌを含む50ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.0）にとかしたもの）） をＳＤＳゲル電気泳動にかけたらチトクロムｃのバンドが２つ出てきました。 これは何故なのでしょうか？ 友人はそれをチトクロムｃ１と、チトクロムｃ２とに分けているのですがそれでも良いのでしょうか？ もしかしたら教授が2種類入れているのかな？とも思ったんですが・・・。 おねがいします。
- ベストアンサー
- 化学
- リゾチームの精製について
学校の実習でリゾチームを精製するために陽イオン交換カラムを用いてタンパク質を分離し、SDS-PAGE法を用いてリゾチームを検出して、染色(ＣＢＢ染色)後、ゲルを観測したんですが、結果から精製がうまくいったかどうかはどのように判断すればよいのでしょうか？ ちなみにゲルには、硫安塩析画分原液×1個→50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ5.0)を15ｍＬを加えた後陽イオン交換カラムの溶出液3ｍＬ×3個(No.(1)～(3))→50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ5.0)/0.5Ｍ塩化ナトリウムを5ｍＬ加えたあとの溶出液1ｍＬ×5個(No.(4)～(8))→50ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ5.0)/1Ｍ塩化ナトリウムを5ｍＬ加えたあとの溶出液1ｍＬ×4個(No.(9)～(12))、標準リゾチーム溶液(0.5ｍｇ/ｍＬ)×1個、分子量マーカー×1個の合計15個のサンプルを用いています。 また、No.(4)～(6)が１番染色が濃く出たのですが、この３つを混ぜて次にどういうカラムにかければきれいに出ますか？ 分かる人がいましたら是非教えてほしいです。
- 締切済み
- 化学
- カラムクロマトグラフィーの実験するのですが
実験所を読んで気になったことがあるのでよかったらアドバイスをお願いいたいします まず手順の簡単な流れです (1)カラムを立て脱脂綿を軽く詰め階差を入れる (2)シリカゲル粉末（ワコーゲル3000）を溶媒（シクロヘキサン：酢酸エチル：アセトン 13:1:1）を加えよく攪拌する (3)ゴム栓の付いた棒で叩き気泡を抜きシリカゲルを沈着させる (4)コックを開き溶媒を流出させゲル上面ぎりぎりまで抜きまた叩く (5)試料をいれ分離を開始させる (6)二層に分かれたのを観察し試験管にとる です そこで気になったのが １溶出溶液でシクロヘキサンだけを使うどうなるか（極性が弱いためどうなるのか？） ２(4)でなぜまた叩く作業がいるのか（ゲル粉末が細かいからさらに沈着させたいため？） ３分離をする際流出速度を速くするとどうなるのか（バンドの位置がずれるのでしょうか？） ４二種の化合物が3/4位まで来たとき溶出をやめ放置しておいたら混合物となって出てくるのでしょうかまたどうしてでしょうか 長くなりましたがもしわかるところがあったらよろしくお願いいたします
- ベストアンサー
- 化学
- カラムの吸着
こんにちは。いつも質問にお答え頂き感謝しています。 タンパク質の精製を始めたのですが、タンパクのカラムへの吸着がおかしく、イオン交換で塩濃度を上げて溶出していくと、今まで目的のタンパクが溶出される場所以外でも溶出されてしまい、困っています。 具体的に言いますと、陽イオン交換で、0～1000mMまで塩濃度を上げていくと、以前でしたら400～500ｍＭで溶出されていたのが、現在では300～600ｍＭと広い範囲で溶出されてきます。フロースルーやWashでは溶出されてきません。重力落下法で精製を行い、ゲルは毎回新品を使っています。原因としては、タンパク質の量が増えたため、カラムの吸着能を超えた結果、溶出される範囲が広がってしまったのかと考えています。 乱文で申し訳ございませんが、みなさまのご意見をお聞かせください。よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 酵素の基質特異性の曖昧さ
ばく然とした質問ですみません。先日酵素タンパク質について調べておりましたが、その中で、「PCBの生分解を追跡する際に基質特異性の曖昧さ（広がり）に着目して類縁体を用いた分析手法が検討されている」との内容の文章を見つけました。一般に基質特異性といえば、「ある特定の化合物（基質）にのみ作用する」と理解しておりましたので、よく理解できませんでした。どなたかお詳しい方、御教授お願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- イオン交換クロマトグラフィーのときに・・・
先日学生実験で陰イオン交換クロマトグラフィーによるタンパク質の分離を行いました。 等電点の違いによりタンパク質は溶出しますが、イオン交換体であるゲルは溶出しないはずです。なのになぜか目に見えて体積が減っていったので気になりました。 どうしてこのようなことが起こるのか分かる方がおりましたら教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
どうもありがとうございます！！ 私は分配～とイオン交換～を同じものと思っていたようです。 ゲルろ過はサイズ排除クロマトの１種なんですね、 それもわかっていませんでした。 困難なケースは私も最初そう考えたんですが、 そんな簡単でいいのかな？と思ったんです。 でもtaronbeさんも同じように考えられたということを聞いて、 これでいいように思えてきました。 ありがとうございます！