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たんぱく質の精製・構造解析について
現在抱えている課題の中で本当にどこから手をつけていいのやら悩んでしまったものが..... 【あるたんぱく質Aの生物的活性を保ったままに精製し、一時構造を解明する実験の手順を考えよ。 ただし3回の条件の異なるイオン交換クロマトグラフィを必ず行うこと。】 というものです。 タンパクの性質は大体要約すると 分子量約90,000、細胞質に分布 等電点7,5付近 SDS-PAGEで45,000 硫安濃度40～60％に分画 pH3以下で失活、6～8,5ぐらいで安定 pH8,2での陽イオン交換クロマトで0,1M NaClで溶出 pH6,5での陰イオン交換クロマトで0,05M NaClで溶出 たんぱくAはある酵素で、化合物Zにも結合できる、しかしZはほかの多数のタンパクにも結合してしまう。 Zに結合する他のタンパクは、イオン交換クロマトで除ける。 【使えるもの、機材】たんぱくAと特異的に反応する抗体１・２ 抗体1と結合した担体（A） Zと結合した担体（B） 各種実験に必要なものはすべてある 大体はこんなところです。タンパクAは実際にはないもののようです。 自分でも考えてみたのですが、とりあえずどこからはじめればいいのかまるで見当がつきません！！ だいたいの流れだけでもわかる方、ぜひ教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いします！！
- nosuke13
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- kozima-da
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最初にホモジェナイズして硫安して、ゲル濾過して、イオン交換３回やって、アフィニティやるんだよ。 授業８回出て、２回のレポート出してれば単位大丈夫だよ。 小嶋
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大学院入試の過去問です。 『タンパク質を分離精製するカラムクロマトグラフィについて原理の異なるものを４つ説明し、それぞれ目的タンパク質の「分離精製が困難なケース」について述べよ。』 私のわかる範囲では (1)イオン交換クロマトグラフィ タンパク質の電荷で分離。溶媒のpHや塩濃度を変えて分離していく (2)ゲルろ過クロマトグラフィ 大きさで分離。小さい分子はゲルの小孔に入り込むため溶出が遅れる (3)アフィニティクロマトグラフィ 抗原抗体反応や基質特異性などの、タンパク質が特定の化合物と結合する性質を利用。 以上の３つしかわかりません。もうひとつは何なのでしょうか？ 「分離精製が困難なケース」については教科書３冊を用いて調べても載っていませんでした。 わかる方、どうかよろしくお願いします！！
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はじめて質問します。学生です。 原株からあるNADPH依存のタンパク質を単離精製しているんですが、収量が少なく、より良い精製法を検討中です。 NADPH特異性のあるCibacron Blue F3GA色素を担体リガンドとした、いわゆるBlueカラムを試したのですが、目的酵素が結合せず、うまくいきません。（正確には少し結合しているようで単ピークで溶出するのですが、素通り画分の方が酵素活性が高い状態です。ベット量はカラムのタンパク質結合容量以下でやっています。） 至適ｐＨのリン酸バッファーで、KClでグラジエント溶出しています。 （カラムの説明書通りの条件です。ただし説明書ではアルブミンを精製しています。） 結合しない原因は何なのでしょうか？ 或いは陥りやすい操作ミスなど、少しでもわかる方は是非教えてください。 また、文献を探したところ、酵素溶液に基質を加えたり補酵素を加えたりすることで結合容量が増すようなことが書かれているものもあったのですが、その他に検討すべきことはあるでしょうか？ ご存知の方いましたら、ご教授願います。
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