• 締切済み

クロマト前の除タンパクを教えてください

クロマト前の除タンパクについて教えてください。 分析したい成分はフラボノイドなどのポリフェノール類の配糖体で、水に可溶です。 抽出物にタンパクが混じっており、除タンパクの操作が必要です。 エタ沈を試してみたところタンパクと目的成分が共沈してしまいました。 次の操作は陰イオン交換クロマトを予定しています。

  • 科学
  • 回答数1
  • ありがとう数7

みんなの回答

  • xenopus
  • ベストアンサー率71% (15/21)
回答No.1

トリクロロ酢酸、過塩素酸による除タンパクもあるようですが、フラボノイド配糖体の分析では固相抽出カラム(C18:オクタデシル)で精製している論文が複数ありました。 試料がなんであるか、またどのような抽出液(メタノール?)を選択したのかにもよるので、確かなことはいえません。私自身は分析したことがないので、論文の方法を参照するのが一番良いと思います。固相抽出カラムの前処理、溶出のさせかたなども論文によって微妙に違いました。 他に思いつくものとして、限外ろ過膜による方法です。遠心ろ過のための膜が装着されたチューブユニットも販売されています。「除タンパク」「限外ろ過」などのキーワードで検索するとカタログページがヒットします。

関連するQ&A

  • 蛋白質の可溶化

    GST融合蛋白質を作製・培養した後、sonicationによって可溶化の誘導を行いました。 SDS-PAGEによって可溶化の確認を行ったのですが、目的蛋白質以外のバンドが目立ちました。 何度実験してもそのような結果で、大学院生に「蛋白質が壊れているか、不要な成分が溶け出しているんじゃないか」と教えてもらったのですが、不要な成分とはどういうことでしょうか? 教えてください。

  • イオン交換クロマトグラフィー

    現在、大学でタンパクの精製を行っています。 疎水クロマト、陰イオン交換クロマト、ゲルろ過の順番で行ったのですが、まだ精製しきれていません。 そこで、陽イオン交換クロマトも間にいれてやってみようかなと計画しています。 そこで疑問に思ったのですが、陰イオン交換クロマトと陽イオン交換クロマトと続けて行っても大丈夫なのでしょうか? 自分の考えではいらないタンパクが除去されて上手くいくかなと思っています。 過去に前例などがあればそちらの紹介もよろしくお願いします。 足りない点は補足いたしますのでよろしくお願いします。

  • 陰イオン交換クロマト

    陰イオン交換クロマトで質問があります。 一般的にNaCl濃度勾配で目的物を溶出ような印象があります。しかしpH変化でも可能ですよね?なぜpH変化で溶出してくる例が少ないのでしょう?またpH変化で行う場合、どのような溶出溶媒をどのように変化させればよいでしょうか?回収するターゲットのイオン性部分はカルボキシル基または硫酸基だけです。例えばDEAEなどの弱陰イオン交換では、単体に結合できる目的物がpHにより変化します。それは、カルボキシル基や硫酸基のpKaにpHが達しなくても、弱陰イオン交換の保持可能pHの領域の外にpHがなれば、目的物は回収されてくるのでしょうか?逆に強陰イオン交換では、単体に結合できる目的物がpHにより変化しにくいです。つまりpH濃度勾配で溶出するためには、目的物のpKaよりもpHを小さくしなければならないということでしょうか? また現在、強陰イオンと弱陰イオン交換で酢酸ナトリウムを緩衝液として用いてNaCl濃度勾配で目的物を回収し、その後ゲル濾過でMeOHと水の混合液で目的物を回収してします。しかしながら、精製が十分ではありません。より精度の高い回収をするためはどうしたらよいでしょうか?ただし逆相カラムは使わない方向でお願いします。溶媒条件や違う精製法がある場合教えて下さい。 現在、カルボキシル基や硫酸基だけを有するものを回収しようと試みているのですが、経験的にカルボキシル基のみを有する化合物はどの程度のイオン強度で溶出されてくるか、わかりますか? 回答宜しくお願いします。

  • たんぱく質の精製・構造解析について

    現在抱えている課題の中で本当にどこから手をつけていいのやら悩んでしまったものが..... 【あるたんぱく質Aの生物的活性を保ったままに精製し、一時構造を解明する実験の手順を考えよ。 ただし3回の条件の異なるイオン交換クロマトグラフィを必ず行うこと。】 というものです。 タンパクの性質は大体要約すると 分子量約90,000、細胞質に分布 等電点7,5付近 SDS-PAGEで45,000 硫安濃度40~60%に分画 pH3以下で失活、6~8,5ぐらいで安定  pH8,2での陽イオン交換クロマトで0,1M NaClで溶出 pH6,5での陰イオン交換クロマトで0,05M NaClで溶出 たんぱくAはある酵素で、化合物Zにも結合できる、しかしZはほかの多数のタンパクにも結合してしまう。 Zに結合する他のタンパクは、イオン交換クロマトで除ける。 【使えるもの、機材】たんぱくAと特異的に反応する抗体1・2 抗体1と結合した担体(A)  Zと結合した担体(B)  各種実験に必要なものはすべてある 大体はこんなところです。タンパクAは実際にはないもののようです。 自分でも考えてみたのですが、とりあえずどこからはじめればいいのかまるで見当がつきません!! だいたいの流れだけでもわかる方、ぜひ教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いします!!

  • totalRNA抽出でタンパクのコンタミ

    初めてtotalRNAの抽出を行ったのですが、収率やOD比を測定したところ、 蛋白がコンタミしすぎていて値が1.3付近になってしまいました。 使っているのはQIAzolという試薬でグアニジン・フェノールが含まれています。 グラム陽性菌からの抽出なので機械破砕を行ったのちにクロロホルムを添加して水層とクロロホルム層に分離しました。 通常であれば上の水層にRNAが回収されますよね? 中間層のモヤモヤはタンパクらしいので、水層回収の際は8割くらいしか回収していません エタ沈を行った結果まったくと言っていいほどrnaが回収できませんでした。 心配になったのでクロロホルム層もエタ沈した結果、 こちらからはそれなりの核酸が回収できました。(これはゲノムDNAなのでしょうか) 収率は上々でしたが、OD比(260/280)、(260/230)ともに1.0付近でした。 先行論文ではカラムを用いない抽出方法でtotalRNAを抽出していたため、そのプロトコルを参考に行いましたが、2回連続で失敗してしまいました。 考えられることは、 ・機会破砕が十分でない ・スタートの菌数が多い などですがいろいろと自信がありません。。。 水層にRNAが溶解していない点で、もう分解されてしまっていて、 クロロホルム層の沈殿はゲノムDNAでしかないのでしょうか。 アドバイスよろしくお願いします。

  • グリセリンで抽出できる成分は水溶性?脂溶性?

    ハーブの成分をグリセリンで抽出した場合、抽出されるのは水溶性か脂溶性かどちらの成分でしょうか? あるハーブの書籍では「水溶性」と書いてあるのですが、ネットでは「脂溶性」と書かれている事が多く、困惑しております。 抽出させたい主な成分 アルカロイド(水溶性) カロテノイド(脂溶性) サポニン(難溶性[一部は水溶性]) 植物酸(有機酸・果実酸)(水溶性) ステロール(脂溶性) 精油(脂溶性) 多糖類(グリカン)(難溶性[一部は水溶性]) タンニン(水溶性) 粘液質(水溶性) 配糖体(グリコシド)(水溶性) ビタミン(A/D/E/Kは脂溶性 B群/Cは水溶性) フラボノイド(水溶性[一部は難溶性]) ポリフェノール(水溶性) ミネラル(水溶性) 油脂(脂溶性) ご回答の程、宜しくお願い致します。

  • タンパク分解酵素は分解されないのですか?

    使用しているコンタクトレンズ洗浄液のラベルに 「主成分/タンパク分解酵素、陰イオン界面活性剤」 という表記があるのですが、これが疑問に思えてなりません。 「タンパク分解酵素」の働きはタンパク質の分解です。 「タンパク分解酵素」そのものも、酵素ですからやはり 「タンパク質」から出来ているはずです。 ということは、洗浄液ボトル内のタンパク分解酵素は 同じくボトル内にいるタンパク分解酵素を どんどん分解していってしまうのではないでしょうか? こうしている間にもバラバラのアミノ酸になって、 洗浄液としての働きを失ってしまうのでは?

  • 定性分析・定量分析について

     液体の成分や、物に付着したグリスの成分を分析したいのですが、分析の方法はどのような方法があるのでしょうか。解明したい成分(陽イオンや陰イオン・金属物質・・・)がはっきりしていないと方法は定まらないのでしょうか?漠然とこの液体の成分が知りたいではだめなのでしょうか?

  • HPLCの前処理として適切でしょうか。

    HPLCで試料及び標準品を調製する際に、 標準品は純粋なものを使用し、希釈溶媒は目的成分の抽出溶媒あるいは 移動相というのが一般的です。 又、試料に関しては他のものを新たに加えるのではなく、試料中の目的成分以外のものをできるだけ取り除くように処理するのが一般的だとおもうのですが、目的成分の綺麗なピークを得る為に標準品と試料に添加剤みたいなものを加える方法はHPLC分析法として適当なのでしょうか。(移動相には添加剤は加えない。) こういう分析方法で分析を行っている方おられますでしょうか。 例)・標準品に0.1%硫酸銅水溶液を加える。→メタノールで全量を50mLとし、標準品とする。   ・試料をメタノールで抽出し、硫酸銅水溶液を加える。→メタノールで全量を50mLとし試料溶液とする。   ・移動相:メタノール:水(3:2) 宜しくお願いします。

  • リン酸化タンパクの検出方法教えてください!

    リン酸化蛋白の検出方法に困っています。 組織抽出タンパク中のリン酸化蛋白をウエスタンで検出しようと思っています。 抗体ですとセリン・チロシン・スレオニンそれぞれの特異抗体で検出しなくてはいけないようですが、私の目的としてはいずれのリン酸化タイプでも広く検出する方法はないかと考えています。 そこで、IMAC(金属固定化アフィニティークロマトグラフィー法)を用いたリン酸化蛋白濃縮カラムと同じ原理で、リン酸基と結合するFeなどの金属イオンにHRPやAPを標識したようなものが売っていないか探しています。 知っている方がいらしたらメーカーを教えてください。 また、その他検出方法がありましたらアドバイスお願いします。