totalRNA抽出でタンパクのコンタミ

質問

初めてtotalＲＮＡの抽出を行ったのですが、収率やＯＤ比を測定したところ、
蛋白がコンタミしすぎていて値が1．3付近になってしまいました。

使っているのはQIAzolという試薬でグアニジン・フェノールが含まれています。
グラム陽性菌からの抽出なので機械破砕を行ったのちにクロロホルムを添加して水層とクロロホルム層に分離しました。

通常であれば上の水層にＲＮＡが回収されますよね？
中間層のモヤモヤはタンパクらしいので、水層回収の際は８割くらいしか回収していません
エタ沈を行った結果まったくと言っていいほどrnaが回収できませんでした。

心配になったのでクロロホルム層もエタ沈した結果、
こちらからはそれなりの核酸が回収できました。（これはゲノムＤＮＡなのでしょうか）
収率は上々でしたが、ＯＤ比（260/280)、(260/230)ともに1.0付近でした。

先行論文ではカラムを用いない抽出方法でtotalRNAを抽出していたため、そのプロトコルを参考に行いましたが、２回連続で失敗してしまいました。

考えられることは、
・機会破砕が十分でない
・スタートの菌数が多い
などですがいろいろと自信がありません。。。
水層にＲＮＡが溶解していない点で、もう分解されてしまっていて、
クロロホルム層の沈殿はゲノムＤＮＡでしかないのでしょうか。

アドバイスよろしくお願いします。

回答No.1

yuklamho

『通常であれば上の水層にＲＮＡが回収されますよね？』
OD260はどうだったのでしょうか？OD260の値が低くなければRNA自体は取れているのではないでしょうか。

プロトコル通りにやってみたらどうでしょうか（菌体の量とかその他の条件も含めて）。
https://www.qiagen.com/us/resources/faq?id=2f9c2112-4374-43d8-91d6-04f6cc063af7&lang=en

『クロロホルム層の沈殿はゲノムＤＮＡでしかないのでしょうか。』
電気泳動すれば分かることです。