アルカリSDS法におけるＤＮＡとプラスミドの分離について

質問

大学生になり、生物実験でアルカリＳＤＳを行っている者です。
アルカリＳＤＳによるゲノムＤＮＡとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは１本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、とありました。そしてボルテックスはsolutionIIを加えた以降は禁止で転倒混和ですが、これは激しいボルテックスによりゲノムDNAも粉々になって上清画分に出てきてしまうため、また、膜にゲノムDNAは結合していて膜とともに沈殿させることができるが、DNAが細かく切れると膜とともに沈殿させることができないため、という文もありました。疑問に思うことは以下の6つです。

(1)一本鎖になるとニックが入りやすくなるのに、プラスミドは二本鎖に戻し、ゲノムDNAを一本鎖のままにすることが、ボルテックスなどでゲノムDNAが細かくなるのを防ぎたいということと矛盾している気がします。細かくなると不都合になるのになぜわざわざ一本鎖にするのでしょうか？
(2)その後のエタ沈でDNAを沈殿させますが、一本鎖のほうが二本鎖より沈殿させやすいのしょうか？原理的にはDNAはエタノールに不溶性なため沈殿することを考えると、一本鎖でも二本鎖でも不溶性なことには違いがありませんよね？一本鎖の方がもつれて絡まりやすいから凝集するのでしょうか？
(3)ゲノムDNAは菌体の膜に結合していて一緒に沈殿しやすいというイメージがよく分からないのですが、膜に所々DNAが細胞骨格などとともに結合しているのでしょうか？何かのタンパクを介しているのでしょうか？
(4)solitionIでTris-HCl(pH.8.0)などの緩衝液を加え、菌体をボルテックスして懸濁する必要があるのは後のsolutionII以降の操作のためにどのような目的がありのでしょうか？EDTAでDNaseなどを不活性化するのは分かるのですが…。またグルコースも加えるのは何のためなのでしょう。Tris-HClで十分緩衝液になっている気がします。
(5)エタ沈の前に、フェノールクロロホルム抽出をはさむプロトコールがありました。フェノールクロロホルム抽出をはさまなくても、solutionIIのアルカリ性でタンパクは変性し、不溶性となるので、核酸と分離できるはずですが、はさむ方法もあるのは、よりタンパクを取り除くためでしょうか？
(6)こちらは、確認質問なのですが、エタ沈の目的は核酸の沈殿であって、タンパクとの分離はできませんよね？

ちまちまとすみませんが、どなたかよろしくお願いします。

回答No.1

oil-sour · ベストアンサー

(1)　ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので（じゃまなので）、それを防ぐ為に穏やかな条件で回収しているのではないでしょうか。

(2)これはエタノール沈殿の条件では、一本鎖、二本鎖に違いはあまりないと思います。

(3)細胞質中で膜結合性タンパク質との巨大複合体として存在していると言われています。sol3の後の遠心で一緒に巻き込まれて沈殿する、というようなイメージではないでしょうか。

(4)EDTA等は、仰るようにDNAの安定化の為だと思います。
グルコースは浸透圧のコントロールとして、また後のエタノール沈殿のときにはDNAの共沈剤の効果があると言われています。浸透圧のコントロールとして塩を加えてもよいのですが、塩はDNAと不溶性複合体をつくりますので、最近のプロトコルはglucoseみたいですね（私が学生の頃はEDTA以外特になにも入っていませんでした）。後者はエタ沈の時にグリコーゲンを加える事があるのと一緒ではないでしょうか。

(5)仰るようにタンパク質を完全に除去する為です。目的によっては省略してもよいでしょう。また、フェノクロの後はフェノールを完全に除去するためにクロイソ処理が必須です。

(6)この場合のエタ沈はプラスミドDNAを単離することです。が、sol.3を回収すればタンパク質の分析も・・・できるかも。実際にQIAGENなどからは１本の培養系からDNA、RNA、タンパク質を同時に精製するkitがあります（ありました。今はちょっとわかりません）

(2)と(3)はゲノムDNAのtopologyの問題ですかね。
僕は専門ではありませんので、曖昧です。すみません。

補足

ご回答ご丁寧に、しかも早いお返事をありがとうございました。
ご回答について一つほど質問させていただきたいです。
＞プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます
この文に関してなのです。DNAは二本鎖になる方が可溶性が高いのはなせでしょうか？一本鎖より二本鎖の方がリン酸基のマイナスチャージが大きいからでしょうか？
再びすみません。

回答No.2

oil-sour

#1です。補足です。

>>プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます
>この文に関してなのです。DNAは二本鎖になる方が可溶性が高いのはなせでしょうか？
>一本鎖より二本鎖の方がリン酸基のマイナスチャージが大きいからでしょうか？

一本鎖と二本鎖の可溶性の違いは、よくわかりません。（感触として、一本鎖DNAも普通にエタ沈してるので、そんなにかわらないんじゃないかなあ。）

プラスミドを含む小さなDNAが可溶性画分に移るというより、ゲノムの様な大きなDNAが沈殿する、というイメージです。
断片化した小さなDNAは一本鎖、二本鎖を含め、可溶性画分にコンタミする・・・と思います。

(2)はDNAの化学的性質として、(3)はゲノムのトポロジーの問題として別の質問をたててみてはどうでしょうか。

お礼

ご丁寧にたびたびありがとうございました。大変参考になりました。
（２）については、別の質問として出させていただこうと思います。
ありがとうございました。