アルカリ滅菌法

質問

アルカリ滅菌法の最後にプラスミドＤＮＡの沈殿が得られたところで、ＴＥbufferを加える理由を教えてください。

また、ここでＴＥbufferではなく、誤ってＤ.Ｗ.を加えてしまったら何が起こるのでしょうか？？

どうすればこの失敗から回復できるのでしょうか。。

どなたかご存知でしたら教えてください！！

よろしくお願いいたします

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

水でも大丈夫ですよ。あとの反応にバッファー成分を持ち込みたくない場合にはあえて水で溶かすこともあるくらいですから。

TEを使うと良いという理由は、主にDNAの保存性、安定性がいいからです（水だからといってすごく不安定になるということはありません）。
DNAは酸なので、水溶液は酸性になるのでDNA自らを傷める原因になります。
中性～弱塩基性のバッファーに溶かしてやったほうが長期間安定です。
また、EDTAが含まれていて、DNaseの活性に必要な二価陽イオンをキレートするため、DNaseのコンタミにも強いと言われています。
（実際はDNaseの活性を奪うほど濃度が高いとは思えないので、私は疑問に思っています。むしろ、DNAの沈殿が二価の陽イオンを含みこれと塩を作っていると、再溶解しにくいためEDTAをいれることに意味があるのだと思っています）。

水で溶かしたものをTEに変えたい、というのなら
1. エタノール沈殿してTEに溶かし直す。
2. 10x TE（100 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM EDTA)を水溶液の10分の1体積（正確には9分の1）入れる。

お礼

ＤＮＡの保存性、安定性のためだったのですね。

他にも役に立つ情報をありがとうございます。
もっともっと勉強せねば、、

もう一度教えていただいた情報と実験テキストを見てレポートを書きたいと思います。

本当にありがとうございました！！！！

回答No.4

kazu2960

みなさんのいう通りですね。

アリカリ滅菌法ではなくて、アルカリ法の間違いじゃないですか？
アルカリ法でDNAを抽出しますから。

TEにはEDTAを混ぜているので、キレート剤のEDTAがマグネシウムイオンをトラップして、DNAseを不活性化させます。長期保存するならTEがよいですが、すぐに使用してしまうなら水でもかまいません。

プラスミド等はデリケートなので、強いショックやpHの変化で構造が壊れてしまいます。ソリューションの組成を勉強してみると実験も楽しくなりますよ。

お礼

アルカリ法なのですね・・・。

学校で配られたテキストだけを頼りにしてると恐ろしい目に・・・。

ありがとうございます。

水でも大丈夫と聞き安心しました！！

ありがとうございました！！

回答No.3

miya_0726

精製DNAの最大の敵であるDNaseは、その活性を発揮するためにマグネシウムイオンを必要とします。TEバッファーに含まれるEDTAはキレート剤の役割を果たし、マグネシウムイオンを含む金属イオンをトラップするため、TEバッファーに溶かしたDNAはDNaseの混入に強くなります。
TEバッファーの代わりに純水を使っても、DNAが少々溶解しにくくなる程度で、普通は問題ないです。ただ、経験上長期保存したときに分解されている率は高かったです。
現状純水に溶解しているDNAをなんとかしたいのでしたら、エタノール沈殿をやってバッファー交換するのがよいでしょう。お金があるならDNAをトラップするカラムキットを使えばより簡単です。

お礼

ＴＥbufferを使う理由が納得です。
ありがとうございます。

カラムキットを使うという方法もあるのですね！！

ありがとうございます！！！

回答No.2

geneticist12

ところで「アルカリ滅菌法」とい呼称はなにかの間違いでは？

お礼

実験テキストにアルカリ滅菌法となっていたのですが。
やはり検索しても出てこないのは呼称が違うのですね・・・。

ありがとうございました！！