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plasmid DNAがない

先輩から目的遺伝子が組み込まれたplasmidを、 competent cellに感染させ、増やして欲しいと 言われ実験をおこなっています。 しかし、コロニーピックアップし一晩培養した 培養上清を回収し、QIAGENのキットでプラスミドDNAの 抽出をおこなったのですが、全てDNAが10ng程度しかなく、 困っています。 私の考えでは、抗生物質含有の培地のコロニーを ピックアップし、さらにスケールアップする際も 抗生物質含有の培地で培養したので、プラスミドDNA が入っていないとは考えられないのですが、、、。 今のところ、キットでタンパク沈殿させた際の DNAの濃度をはかり、プラスミドの増殖をチェックし ようと考えています。(キットの操作には間違いは ありませんでした) 何か、考えられる原因があれば詳しい方お教えください。 ちなみに今までの実験の流れは、以下のように行いました。 1.plasmid DNA(invitrogen pcDNA3.1)を one shot competent cellに感染させる 2.アンピシリン含有LB培地によりセレクション 3.コロニーを一晩5mlのアンピシリン含有LB培地で培養しスケールアップ 4.1mlの上清回収し、プラスミドDNA抽出

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  • 生物学
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みんなの回答

  • 回答No.4
  • Dr_Hyper
  • ベストアンサー率41% (2480/6025)

invitrogen pcDNA3.1は大腸菌へのダメージが大きい場合が多く(理由はわかりません)、ちゃんと大腸菌が増えてもplasmidを落としていることがあります。competnet cellをHB101のようなよく増える株に変えてやるとか、Ampのかわりにカルベニシリン(carbenicillin)を使用すると良い場合が多いです。とりあえずいろんな操作が不安であれば、まずplateに生えたコロニーをPBSなどを少量かけてからスクレパーでカキとってmini-prepします(今のkitで問題ありません)。plate状でコロニーになっていればほとんどの場合plasmidを落とすことがありませんので、とにかくそれで確認後、ちゃんとplasmidがあれば上記の抗生剤や株をかえることを試してください。もしそれでもだめな場合はplateを何枚も用意してplateで増えた分を回収してとれるだけとってkitでとります。スマートではありませんが先輩にせかされるのであれば一番近道です。

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質問者からの補足

夜遅く、朝早く?ご回答有り難うございます。 plasmidの脱落ですか。そういうことも、あるんですね。 plateに生えたコロニー中にプラスミドDNAがあるかを チェックする方法で、コロニーからmini-prepをする方法を 教えて頂きましたが、このスケールからどのくらいDNAは 取れる物なんでしょうか? 方法としては、コロニーピックアプし、 一部を滅菌水などに落とし遠心により集菌し、 キットのプロトコルどおり行えばいいのでしょうか? 本を読んだら、コロニーからPCRする方法で 確かめる方法もあるようですが、、、。 すいません、質問だらけで。

  • 回答No.3
  • MIYD
  • ベストアンサー率44% (405/905)

大腸菌の中のプラスミドが少ないのか、 カラムの問題かわからないので、 5ml中1ml分しかカラムにかけないのでしたら、 先に1mlをアルカリSDS法で取ってみてはいかがでしょうか。 インサートが大きいプラスミドでしたら、 そのくらいの収量しかないのかもしれません。 前に増やした人に確認して、 場合によっては1~2Lくらい振ることになるかもしれません。

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質問者からのお礼

夜遅くご回答ありがとうございます。 確認してみます。

  • 回答No.2
  • -ROM
  • ベストアンサー率35% (33/93)

だから「上清」だから駄目なのではないですか (上清の意義は理解されていますか)。

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質問者からの補足

訂正します。 培養上清→大腸菌の培養液 1mlの上清→1mlの大腸菌培養液

  • 回答No.1

>培養上清を回収し、QIAGENのキットでプラスミドDNAの抽出を プラスミドが取れないのは当然です。 培養上清にはプラスミドは含まれていません。 プラスミドは、細胞の中にあるのです。

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質問者からの補足

済みません、書き方がまずかったです。 培養した上清を遠心して、培地除去後 ペレットからプラスミドDNAの抽出を おこなっています。

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