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plasmid DNAがない
先輩から目的遺伝子が組み込まれたplasmidを、 competent cellに感染させ、増やして欲しいと 言われ実験をおこなっています。 しかし、コロニーピックアップし一晩培養した 培養上清を回収し、QIAGENのキットでプラスミドDNAの 抽出をおこなったのですが、全てDNAが10ng程度しかなく、 困っています。 私の考えでは、抗生物質含有の培地のコロニーを ピックアップし、さらにスケールアップする際も 抗生物質含有の培地で培養したので、プラスミドDNA が入っていないとは考えられないのですが、、、。 今のところ、キットでタンパク沈殿させた際の DNAの濃度をはかり、プラスミドの増殖をチェックし ようと考えています。（キットの操作には間違いは ありませんでした） 何か、考えられる原因があれば詳しい方お教えください。 ちなみに今までの実験の流れは、以下のように行いました。 １．plasmid DNA（invitrogen pcDNA3.1)を one shot competent cellに感染させる ２．アンピシリン含有LB培地によりセレクション ３．コロニーを一晩5mlのアンピシリン含有LB培地で培養しスケールアップ ４．１mlの上清回収し、プラスミドDNA抽出
- kakyouin
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- Dr_Hyper
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invitrogen pcDNA3.1は大腸菌へのダメージが大きい場合が多く（理由はわかりません）、ちゃんと大腸菌が増えてもplasmidを落としていることがあります。competnet cellをHB101のようなよく増える株に変えてやるとか、Ampのかわりにカルベニシリン（carbenicillin）を使用すると良い場合が多いです。とりあえずいろんな操作が不安であれば、まずplateに生えたコロニーをPBSなどを少量かけてからスクレパーでカキとってmini-prepします（今のkitで問題ありません）。plate状でコロニーになっていればほとんどの場合plasmidを落とすことがありませんので、とにかくそれで確認後、ちゃんとplasmidがあれば上記の抗生剤や株をかえることを試してください。もしそれでもだめな場合はplateを何枚も用意してplateで増えた分を回収してとれるだけとってkitでとります。スマートではありませんが先輩にせかされるのであれば一番近道です。
- MIYD
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大腸菌の中のプラスミドが少ないのか、 カラムの問題かわからないので、 5ml中1ml分しかカラムにかけないのでしたら、 先に1mlをアルカリSDS法で取ってみてはいかがでしょうか。 インサートが大きいプラスミドでしたら、 そのくらいの収量しかないのかもしれません。 前に増やした人に確認して、 場合によっては1~2Lくらい振ることになるかもしれません。
お礼
夜遅くご回答ありがとうございます。 確認してみます。
- -ROM
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だから「上清」だから駄目なのではないですか (上清の意義は理解されていますか)。
補足
訂正します。 培養上清→大腸菌の培養液 １mlの上清→１mlの大腸菌培養液
- ebikichi
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＞培養上清を回収し、QIAGENのキットでプラスミドDNAの抽出を プラスミドが取れないのは当然です。 培養上清にはプラスミドは含まれていません。 プラスミドは、細胞の中にあるのです。
補足
済みません、書き方がまずかったです。 培養した上清を遠心して、培地除去後 ペレットからプラスミドDNAの抽出を おこなっています。
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